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文檔簡介
1、天然免疫系統(tǒng)是多細胞動物抵御細菌的重要防線。Akirin是一類由200個左右氨基酸殘基組成的小分子核蛋白,發(fā)現(xiàn)于果蠅天然免疫系統(tǒng)中,發(fā)揮免疫調(diào)控作用。Akirin同源基因廣泛存在于從低等多細胞生物到高等脊椎動物中,進化上高度保守。已有的研究表明:Akirin在果蠅Imd通路和脊椎動物TLR通路下游,與NF-κB家族轉(zhuǎn)錄因子形成復合物,參與調(diào)控免疫相關靶基因的轉(zhuǎn)錄,是天然免疫調(diào)控機制中不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子,其過表達或缺失直接影響動物對細菌的
2、防御能力。
本文通過比較各物種Akirin1和Akirin2基因cDNA序列確定cDNA序列保守區(qū),根據(jù)保守區(qū)序列設計引物,克隆得到鯉魚Akirin1、Akirin2基因的cDNA片段,然后采用RACE技術得到其全長cDNA,并對其編碼蛋白的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析;采用RT-PCR方法檢測了Akirin1和Akirin2 mRNA在正常鯉魚肝臟、脾臟、前腸、后腸、鰓、頭腎、血液、肌肉、皮膚和口腔上皮等組織的分布。已有報道顯
3、示,Akirin1主要在肌肉生成過程中發(fā)揮作用,而Akirin2則參與天然免疫機制的調(diào)控。結合組織分布實驗結果分析,選擇Akirin2作為后續(xù)免疫功能研究的對象。采用Real-time PCR技術檢測了鰻弧菌浸泡刺激后鯉魚肝臟、脾臟、頭腎、前腸和后腸中Akirin2 mRNA水平的變化,從而驗證鯉魚Akirin在天然免疫調(diào)控中的作用。
鯉魚Akirin1基因cDNA全長1204 bp,由179 bp的5'非編碼區(qū)(5'-UTR
4、),570 bp的開放閱讀框(ORF)和455 bp的3'非編碼區(qū)(3'-UTR)組成,其中ORF區(qū)編碼189個氨基酸的Akirin1肽鏈,23~27位序列KRRRC為核定位信號。鯉魚Akirin2基因cDNA全長1290 bp,由192 bp的5'非編碼區(qū)(5'-UTR),555 bp的開放閱讀框(ORF)和543 bp的3'非編碼區(qū)(3'-UTR)組成,其中ORF區(qū)編碼184個氨基酸的Akirin2肽鏈,23~27位序列與Akiri
5、n1相同,為KRRRC的核定位信號。
序列比對和系統(tǒng)進化分析表明,鯉魚Akirin1和Akirin2之間同源性為57.2%,其中鯉魚與斑馬魚相似性最高,二者Akirin1的相似性為97.9%,Akirin2的相似性為89.4%;在進化樹中,脊椎動物與昆蟲等處于不同的分支上,脊椎動物分支上,Akirin1和Akirin2處于兩個平行分支,每個物種按親緣關系遠近再分布于不同分支。由此看來,Akirin1和Akirin2各自存在進化
6、保守性,推測二者功能也可能存在差異。
RT-PCR檢測表明,在正常鯉魚中,Akirin1 mRNA在除血液外的其他組織中表達量基本恒定,血液中Akirin1表達量較少;Akirin2 mRNA的表達水平在肝臟、脾臟、前腸和頭腎中較高,其次為鰓、肌肉和皮膚,在后腸和血液中的水平較低。
Real-time PCR檢測表明,鯉魚經(jīng)過鰻弧菌浸泡刺激后,各組織中Akirin2 mRNA的表達量都發(fā)生了明顯的上調(diào),刺激后6小時A
7、kirin2 mRNA在各組織的表達量都達到最大值,其中肝臟中表達量達約為正常表達的2倍,其余組織表達量在1倍以上;之后表達量逐漸下降,肝臟、脾臟、頭腎中表達量下降較為明顯,而前腸、后腸則表現(xiàn)出下降趨勢,變化不明顯。
鯉魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類,研究鯉魚的天然免疫機制,能夠豐富魚類免疫資料,為深入了解魚類疾病的發(fā)生機理提供理論依據(jù),進而提升淡水魚類免疫力,減少魚病的發(fā)生,創(chuàng)造一定的經(jīng)濟價值。本文克隆得到鯉魚Akirin1、A
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