黃河鯉魚兩種Cyp19基因的克隆、時(shí)空表達(dá)及免疫細(xì)胞化學(xué)定位.pdf

1、在魚類性腺中，雌激素可由Cyp19基因編碼的細(xì)胞色素P450芳香化酶(aromatase)催化雄激素轉(zhuǎn)化而來(lái)。因此，Cyp19基因及其產(chǎn)物芳香化酶對(duì)于協(xié)調(diào)、維持類固醇激素之間的生理平衡有重要作用，研究Cyp19基因及芳香化酶對(duì)于了解魚類性別分化和性別決定的分子機(jī)制具有十分重要的意義。 本研究采用RT-PCR法，根據(jù)已知硬骨魚Cyp19基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)嵌套簡(jiǎn)并引物，分別從黃河鯉魚腦和性腺中擴(kuò)增并克隆得到兩個(gè)不同的Cyp19 DNA

2、片段，其中Cyp19a片段長(zhǎng)700bp，Cyp19b片段長(zhǎng)440bp。將兩個(gè)片段克隆至pUCm-T載體，以M13+，T7/M13-啟動(dòng)子序列為通用引物，采用雙脫氧鏈末端終止法進(jìn)行測(cè)序。同源性分析發(fā)現(xiàn)，與所得序列有較高相似性的前100個(gè)序列均為來(lái)自不同脊椎動(dòng)物的Cyp19基因，最高同源性均對(duì)應(yīng)于金魚的Cyp19基因，分別為Cyp19(88.2％)和Cyp19b(97.5％)。依據(jù)Cyp19基因的命名規(guī)則，我們將其分別命名為CcCyp19a

3、、CcCyp19b。系統(tǒng)發(fā)育分析表明黃河鯉Cyp19a和Cyp19b分別與其他硬骨魚類的Cyp19a和Cyp19b屬于同一分支，并且也顯示了黃河鯉和金魚分類地位最近，和傳統(tǒng)的分類地位相一致。 以GAPDH基因?yàn)閰⒄栈颍瑢?duì)黃河鯉在不同發(fā)育階段的成體組織和不同發(fā)育時(shí)期的胚胎中Cyp19a和Cyp19b基因的半定量。RT-PCR表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，兩種Cyp19基因均在在卵巢和腦組織中大量表達(dá)，在精巢、腎臟、肝組織中微量表達(dá)，而

4、且，在卵巢中Cyp19a的表達(dá)高于Cyp19b，腦中則剛好相反。在胚胎中二者的表達(dá)模式有些相似，Cyp19a和Cyp19b在尾芽期表達(dá)量最高，其次是神經(jīng)胚、卵黃吸收期和孵出期?？傮w上，在黃河鯉胚胎的不同發(fā)育時(shí)期及各階段成體組織中，Cyp19b的表達(dá)高于Cyp19a。 免疫化學(xué)的研究結(jié)果顯示，芳香化酶在卵巢和精巢內(nèi)均呈現(xiàn)免疫細(xì)胞陽(yáng)性，這與RT-PCR的結(jié)果相一致，提供了有力的形態(tài)學(xué)和分子水平的依據(jù)。這些結(jié)果為揭示細(xì)胞色素 P450