鯉魚RORγ和STAT3基因的克隆及對Th17細胞免疫功能影響.pdf

1、輔助性T細胞是組成型表達TCRαβ和CD4分子的T細胞，根據CD4+T細胞在受到病原刺激的情況所分泌的細胞因子不同將其分為Ⅰ型輔助性T細胞（Th1）、Ⅱ型輔助性T細胞（Th2）和Th17細胞。其中Th17細胞的名字來源就在于它能夠主要產生IL-17（IL-17A和IL-17F），由它分化而來的天然免疫組分會在適應性免疫與天然免疫共同對抗炎癥反應構建的第一道防線中起作用，而它大多數功能都是由其分泌物，即IL-17所決定的。Th17的作用包

2、括招募中性粒細胞、激活天然免疫細胞、增強B細胞功能、釋放促炎性細胞因子如TNF和IL-1β等。另外IL-17信號通路還可以促進細胞因子和其他炎癥因子，如胞間粘附分子、抗菌肽和金屬蛋白酶的分泌，從而維持正常的機體環(huán)境，避免組織損傷。Th17細胞可由IL-6，TGF-β，IL-21和IL-23共同誘導分化成為成熟Th17細胞，這過程還依賴信號傳導與轉錄活化因子STAT3的激活。另外視黃酸相關孤兒受體RORγ和RORα也能夠作為轉錄因子參與T

3、h17細胞的分化，而RORγ的轉錄活性同時又受到STAT3的調控。
　　目前在硬骨魚中，只有斑馬魚和草魚的ROR基因被鑒定出來，包括RORα1，RORα2，RORβ， RORγ1和RORγ2，并且人們在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中對這幾個基因的表達情況進行了檢測，但對其免疫調控方式和魚類中的免疫學功能并未有研究。而STAT3在硬骨魚中雖研究相對較多，但在鯉魚中STAT3基因克隆與功能研究并無相關報道。
　　本論文以鯉魚為研究模型，首

4、先根據STAT3和RORγ的保守區(qū)設計多對引物克隆得到部分片段并將其進行拼接，首次得到了總長度為2157bp的STAT3基因完整ORF（開放閱讀框）和長度為732bp的RORγ基因編碼片段。用SMART軟件進行蛋白預測分析，確定STAT3含有一個STAT-int（2-122）結構域及一個SH2特征性結構域（583-664），同時還有兩個螺旋結構域（136-223,268-292）。鯉魚RORγ基因的732bp核苷酸編碼243個氨基酸，其

5、中在46-202之間構成了HOLI結構域。我們對該序列與多物種進行比對構建系統(tǒng)進化樹，發(fā)現鯉魚與草魚的RORγ基因處于同一分支，相似性為85％，而STAT3的親緣關系與斑馬魚最為接近。
　　為進一步研究Th17細胞所分泌細胞因子的免疫功能，我們選取了鯉魚IL-17AF2基因作為Th17細胞的功能代表性細胞因子，克隆得到其部分片段后并通過熒光定量PCR分析其組織分布。結果發(fā)現IL-17AF2在頭腎中表達量最高，肝臟次之，其次為脾臟、

6、皮膚、前腸、后腸和鰓。為研究病毒感染后鯉魚免疫系統(tǒng)中IL-17AF2的表達變化，我們用PolyI:C注射刺激鯉魚，同時隊體外鯉魚頭腎白細胞進行刺激，分別在不同的時間段運用Real-time PCR檢測其mRNA水平，結果顯示鯉魚IL-17AF2基因的表達量均被上調，其中在頭腎和皮膚中含量升高最明顯，而在鰓中的升高變化量較小。其中在IL-17AF2基因表達上調最明顯的組織和時間段內，STAT3和RORγ的含量均有相應的升高。綜上檢測結果說