豬有腔卵泡發(fā)育與閉鎖的內(nèi)分泌及分子細(xì)胞學(xué)變化研究.pdf

1、在哺乳動(dòng)物卵巢中，存在大量的各級(jí)卵泡。卵泡生長(zhǎng)過程中，僅有少數(shù)能夠發(fā)育至成熟排卵，絕大多數(shù)卵泡（99％以上）歸于閉鎖。閉鎖是卵泡發(fā)育的正常歸宿，對(duì)于維持卵巢環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義。卵泡閉鎖是許多存活因子和凋亡因子共同參與的復(fù)雜調(diào)控過程，關(guān)于卵泡發(fā)育與閉鎖調(diào)控的研究雖然已有很多報(bào)道，但仍存在許多不明之處。研究卵泡發(fā)育與閉鎖調(diào)控的難度受諸多因素的影響，缺乏適當(dāng)?shù)难芯磕Ｐ鸵彩且粋€(gè)重要原因。近年來(lái)，隨著細(xì)胞凋亡研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到卵泡

2、閉鎖的實(shí)質(zhì)就是卵泡細(xì)胞的凋亡，但顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)理尚不十分清楚。闡明卵泡閉鎖機(jī)制對(duì)于揭示生殖調(diào)控的奧秘，提高卵巢利用率和卵母細(xì)胞成熟率，提高家畜繁殖效率，均具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。
　　 本研究通過分離豬卵巢完整有腔卵泡，采用組織切片技術(shù)進(jìn)行HE染色，觀察分析豬有腔卵泡發(fā)育和閉鎖過程中的形態(tài)學(xué)特征;通過對(duì)分離的有腔卵泡進(jìn)行培養(yǎng)，建立豬有腔卵泡體外培養(yǎng)模型，研究卵泡組織形態(tài)學(xué)與顆粒細(xì)胞凋亡及類固醇激素變化之間的關(guān)系;并采

3、用熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定顆粒細(xì)胞Fas/FasL mRNA水平的變化;研究FSH對(duì)不同大小有腔卵泡的作用及顆粒細(xì)胞凋亡對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響，以期為了解豬有腔卵泡發(fā)育與閉鎖的調(diào)控機(jī)理提供參考數(shù)據(jù)。試驗(yàn)共分6個(gè)部分:
　　 試驗(yàn)一、豬有腔卵泡發(fā)育與閉鎖的組織形態(tài)學(xué)觀察本試驗(yàn)通過分離豬卵巢不同發(fā)育階段的完整有腔卵泡進(jìn)行石蠟組織切片及HE染色，觀察分析豬有腔卵泡發(fā)育和閉鎖過程中的形態(tài)學(xué)變化。分離的豬完整有腔卵泡因其內(nèi)卵泡液含量豐富，

4、用常規(guī)的組織切片技術(shù)難以制作出結(jié)構(gòu)自然、完整的卵泡切片。本實(shí)驗(yàn)采用Bouin氏固定液固定豬分離卵泡72 h，二甲苯∶乙醇(1∶1)過渡法脫水，并適當(dāng)延長(zhǎng)透蠟時(shí)間，所獲豬分離卵泡組織切片質(zhì)量和效果優(yōu)良。觀察表明，豬健康有腔卵泡的卵泡腔周圍存在少量凋亡細(xì)胞;早期閉鎖卵泡的基膜與顆粒層有不同程度的分離，顆粒細(xì)胞相互間連接松散并開始向卵泡腔脫落，個(gè)別小卵泡(＜3 mm)的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COC)脫落于卵泡腔，但并未觀察到卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞

5、的凋亡變化;晚期閉鎖卵泡的泡膜層變形、松弛、外圍有少量脫落細(xì)胞，可見個(gè)別肥大的內(nèi)膜細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，與顆粒細(xì)胞層之間的界限模糊、基膜消失，大量凋亡的顆粒細(xì)胞或凋亡小體充滿卵泡腔。卵泡閉鎖過程中，大（直徑＞5mm）、中(3～5 mm)、小卵泡的細(xì)胞形態(tài)特征無(wú)肉眼可見的差別。形態(tài)學(xué)研究表明，本實(shí)驗(yàn)眼觀檢查卵泡并進(jìn)行早期閉鎖、晚期閉鎖、健康分類的準(zhǔn)確率在76％～92％之間，以健康卵泡的眼觀判定最為準(zhǔn)確，為卵泡的眼觀檢查與分類提供了依據(jù)。<

6、br>　　 試驗(yàn)二、豬有腔卵泡的分離及培養(yǎng)模型的建立本試驗(yàn)首次對(duì)分離的豬有腔卵泡進(jìn)行體外培養(yǎng)，以期建立卵泡發(fā)育與閉鎖研究的體外模型。以TCM199為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，無(wú)血清體外培養(yǎng)從豬卵巢完整分離的大(＞5 mm)、中(3～5 mm)、小(＜3 mm)健康卵泡。體外培養(yǎng)8h時(shí)，各級(jí)卵泡的形態(tài)變化與培養(yǎng)前無(wú)明顯差異;培養(yǎng)16h后卵泡壁血管逐漸模糊，中、小卵泡組的卵泡液發(fā)生輕微渾濁，整個(gè)卵泡逐漸變得不透明，此時(shí)撕開各級(jí)卵泡檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞仍

7、包被有5層及以上的致密卵丘細(xì)胞;培養(yǎng)24 h后各級(jí)卵泡結(jié)構(gòu)雖保持完整，但卵泡表面開始有細(xì)胞脫落、卵泡液渾濁，22.2％小卵泡卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞包被少于5層，少數(shù)卵母細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)濃縮現(xiàn)象;培養(yǎng)48 h后，大、中卵泡的卵泡壁塌陷致使整個(gè)卵泡的張力消失、發(fā)生松弛。此時(shí)83.8％的大卵泡和88.3％的中卵泡，卵母細(xì)胞僅包被1～2層卵丘細(xì)胞，且排列疏松;小卵泡的卵泡壁開始溶解，顆粒細(xì)胞散在分布于卵泡液中，卵泡外觀發(fā)白，卵母細(xì)胞均成為裸卵并發(fā)生退化

8、。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所用無(wú)血清培養(yǎng)體系可有效誘導(dǎo)豬完整有腔卵泡的進(jìn)一步閉鎖，是用于研究促性腺激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等對(duì)卵巢卵泡發(fā)育的影響及類固醇激素作用的一個(gè)適當(dāng)模型。
　　 試驗(yàn)三、豬卵泡發(fā)育與閉鎖過程中顆粒細(xì)胞凋亡與激素變化分析從豬卵巢分離完整的有腔卵泡，先按其質(zhì)量分為3組:健康卵泡、早期閉鎖卵泡和晚期閉鎖卵泡組;按直徑大小再分為3組:大卵泡組卵泡直徑＞5mm、中卵泡組卵泡直徑3～5 mm和小卵泡組直徑＜3 mm。取健康卵泡

9、進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別于0（培養(yǎng)前對(duì)照組）、8、16和24 h，以Annexin-V FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)壁層顆粒細(xì)胞凋亡情況，放射免疫測(cè)定法（RIA）分析卵泡液中雌二醇(E2)和孕酮(P4)濃度的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同大小的健康體內(nèi)卵泡也存在少量的凋亡顆粒細(xì)胞，卵泡閉鎖時(shí)則顆粒細(xì)胞凋亡率顯著增加，這在小卵泡表現(xiàn)得尤為明顯;晚期閉鎖小卵泡中約有60％的顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡。健康大卵泡組卵泡液中E2濃度顯著高于中、小卵泡組;P4濃度與中

10、卵泡組無(wú)差異，但顯著高于小卵泡組。卵泡在不同健康狀態(tài)下，不同大小卵泡的卵泡液中P4/E2比值存在差異。中、小健康卵泡的卵泡液中P4/E2比值均＜5，而健康大卵泡的卵泡液中P4/E2比值＜1。卵泡發(fā)生閉鎖時(shí)，不同大小卵泡均表現(xiàn)出E2濃度顯著下降和P4濃度顯著增加，早期閉鎖大卵泡卵泡液中P4/E2比值＞1，而早期閉鎖中、小卵泡中P4/E2比值在5～15之間;當(dāng)P4/E2比值＞15時(shí)，卵泡則處于晚期閉鎖狀態(tài)。體外培養(yǎng)卵泡8h，顆粒細(xì)胞的總凋亡

11、率（早期凋亡+晚期凋亡）就已達(dá)70％以上，至24 h時(shí)達(dá)81.1％～94.6％。不同大小卵泡組隨培養(yǎng)時(shí)間增加，E2和P4濃度呈逐漸下降的趨勢(shì)，小卵泡組卵泡液中E2和P4濃度在培養(yǎng)的各時(shí)間點(diǎn)均低于大、中卵泡組，但差異不顯著。本試驗(yàn)結(jié)果表明，無(wú)血清卵泡培養(yǎng)體系可明顯誘導(dǎo)培養(yǎng)卵泡的顆粒細(xì)胞凋亡，顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的主要誘因，但卵泡閉鎖程度可因卵泡大小而異，小卵泡似乎更易發(fā)生閉鎖;卵泡液中P4/E2濃度比值可作為有腔卵泡質(zhì)量判定的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。

12、
　　 試驗(yàn)四、豬有腔卵泡顆粒細(xì)胞Fas/FasL mRNA的表達(dá)本試驗(yàn)旨在研究不同發(fā)育階段的豬有腔卵泡Fas/FasL mRNA表達(dá)與顆粒細(xì)胞凋亡的關(guān)系，探討卵泡閉鎖的規(guī)律及分子調(diào)控機(jī)理。從豬卵巢分離完整有腔卵泡，先按質(zhì)量分為健康卵泡、早期閉鎖和晚期閉鎖卵泡3組;再按卵泡直徑大小分為大、中和小3組。取健康卵泡進(jìn)行體外無(wú)血清培養(yǎng)，收集培養(yǎng)0、8、16、24、48和72 h的卵泡壁層顆粒細(xì)胞，用Real time PCRSYBRg

13、reen法檢測(cè)各組卵泡顆粒細(xì)胞Fas及FasL mRNA的相對(duì)表達(dá)量。豬不同發(fā)育階段有腔卵泡的顆粒細(xì)胞中均有Fas/FasL mRNA表達(dá)。卵泡閉鎖時(shí)，F(xiàn)asL mRNA表達(dá)量顯著增加，而Fas mRNA表達(dá)量與健康卵泡組相比無(wú)顯著差異。早期閉鎖卵泡組，小卵泡顆粒細(xì)胞中FasL mRNA表達(dá)量顯著高于大、中卵泡組。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，不同大小卵泡的顆粒細(xì)胞中FasL mRNA水平隨培養(yǎng)時(shí)間顯著增加，培養(yǎng)至24 h達(dá)最大值(P＜0.05);小卵

14、泡顆粒細(xì)胞FasL mRNA水平均高于大、中卵泡組。不同大小卵泡顆粒細(xì)胞Fas mRNA相對(duì)表達(dá)量在培養(yǎng)前(0 h)差異不顯著，培養(yǎng)8h時(shí)顯著增加，48 h達(dá)最大值。本實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)在豬各級(jí)有腔卵泡閉鎖過程中，對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡具有重要的調(diào)節(jié)作用。體內(nèi)外調(diào)節(jié)Fas mRNA表達(dá)的因素存在差異性;體內(nèi)FasL的高表達(dá)可能是啟動(dòng)Fas/FasL凋亡通路的主要誘因。
　　 試驗(yàn)五、FSH對(duì)分離的豬有腔卵泡體外培養(yǎng)的作用采用

15、所建立的豬有腔卵泡體外無(wú)血清培養(yǎng)體系，研究探討FSH對(duì)豬有腔卵泡體外培養(yǎng)的影響。從豬卵巢分離大、中、小健康的完整卵泡，以TCM199為基礎(chǔ)培養(yǎng)液分別添加1、3、5 IU/mL FSH進(jìn)行無(wú)血清體外培養(yǎng)，于培養(yǎng)的0、8、16、24、48和72 h，用Annexin-V FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組顆粒細(xì)胞凋亡率，Real time PCR法測(cè)定FSH對(duì)壁層顆粒細(xì)胞中Fas與FasLmRNA相對(duì)表達(dá)量的影響，RIA法測(cè)定卵泡液中E2

16、和P4濃度的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加1IU/mL FSH對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡的抑制作用并不顯著，F(xiàn)as與FasL mRNA表達(dá)量在培養(yǎng)的各個(gè)時(shí)間均與對(duì)照組無(wú)異。添加3～5 IU/mL FSH可顯著抑制各級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出劑量依賴性;對(duì)大卵泡顆粒細(xì)胞的作用尤為明顯。5 IU/mL FSH可降低各級(jí)卵泡顆粒細(xì)胞Fas和FasL mRNA表達(dá)量，以24 h培養(yǎng)組作用最為顯著;3 IU/mL FSH對(duì)Fas mRNA表達(dá)量無(wú)顯著抑制作用。FS

17、H可促進(jìn)大、中和小卵泡E2和P4的分泌，但均未達(dá)顯著水平。
　　 試驗(yàn)六、豬卵泡發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響本試驗(yàn)旨在研究卵泡細(xì)胞凋亡對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響，以期了解卵泡完整性在支持和促進(jìn)豬卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過程中所發(fā)揮的作用。測(cè)量豬不同發(fā)育階段有腔卵泡卵母細(xì)胞的直徑變化;并將3～5 mm直徑的健康卵泡及同等大小卵泡來(lái)源的COC分成2組進(jìn)行體外無(wú)血清培養(yǎng)，培養(yǎng)8 h后分別取卵泡組壁層顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞及COC組卵丘

18、細(xì)胞，用Annexin V-FITC/PI法進(jìn)行凋亡分析;結(jié)合FDA染色進(jìn)行卵母細(xì)胞存活鑒定，體外受精后進(jìn)行卵裂率對(duì)照。結(jié)果表明，隨著有腔卵泡的生長(zhǎng)，其卵母細(xì)胞的直徑有顯著增加;當(dāng)卵泡直徑達(dá)5 mm以上時(shí)，卵母細(xì)胞直徑可達(dá)成熟時(shí)的大小。中、小卵泡一旦發(fā)生閉鎖，卵泡發(fā)育就告終止;中卵泡組發(fā)生早期閉鎖時(shí)，其卵母細(xì)胞直徑與健康組相比無(wú)差異，此時(shí)偶見少量卵母細(xì)胞(5％)發(fā)生死亡;晚期閉鎖時(shí)，中卵泡組卵母細(xì)胞直徑和存活率均顯著下降，但其存活率仍顯

19、著高于小卵泡組。小卵泡卵母細(xì)胞直徑和存活率在卵泡早期閑鎖時(shí)即顯著下降;而早期閉鎖大卵泡組卵母細(xì)胞的直徑和存活率與健康組無(wú)異。與大、中卵泡相比，卵泡閉鎖對(duì)小卵泡COC形態(tài)變化的影響更為明顯，但晚期閉鎖小卵泡卵母細(xì)胞依然有80％以上包被3層及以上的卵丘細(xì)胞。培養(yǎng)卵泡組的卵丘細(xì)胞凋亡率要顯著低于培養(yǎng)COC組，但兩組的卵母細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異;培養(yǎng)卵泡組所獲卵裂率顯著高于培養(yǎng)COC組（24.55％對(duì)0％，P＜0.05），但均明顯低于常規(guī)COC成