豬卵泡閉鎖的特征與miRNA調(diào)控研究.pdf

1、雌性哺乳動物中，僅有極少數(shù)卵泡發(fā)育成熟并排卵，絕大部分卵泡(70％-99％)在發(fā)育過程中退化，最終被機(jī)體清除，這一過程稱之為卵泡閉鎖。卵泡發(fā)育的各個(gè)階段均可能發(fā)生閉鎖，這是一個(gè)正常的生理過程，但卻是絕大部分卵泡命運(yùn)的終點(diǎn)。長期以來，人們對卵泡閉鎖展開了大量研究工作，但迄今為止，調(diào)控卵泡閉鎖確切的分子機(jī)制尚未闡明，仍然需要進(jìn)一步的研究和探索。闡明這一生理過程的分子機(jī)理對于豐富繁殖理論、提高動物繁殖力、促進(jìn)胚胎工程發(fā)展、治療人類生育類疾病具

2、有十分重要的意義。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)稱之為miRNA（即microRNA）的小RNA家族廣泛參與了有機(jī)體的各項(xiàng)生命活動，如胚胎發(fā)育、物質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。miRNA正以其種類多樣、功能廣泛的特點(diǎn)受到越來越多研究者的關(guān)注，成為目前研究的熱點(diǎn)之一。
　　 本論文選取豬為試驗(yàn)動物，主要進(jìn)行了以下幾方面的研究:(1)觀察豬卵泡閉鎖的特征，分析表觀觀察、卵泡液顆粒細(xì)胞密度、卵泡液P/E比值

3、三指標(biāo)在判斷卵泡閉鎖程度上的關(guān)系;(2)檢測3～5 mm中等大小卵泡閉鎖過程中的凋亡通路，對重要凋亡通路配體基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行初步探索;(3)建立卵泡閉鎖過程中miRNA表達(dá)譜，篩選卵泡閉鎖過程中，尤其在閉鎖啟動過程中差異表達(dá)的miRNA，并對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因及功能分析;(4)從差異表達(dá)的miRNA中選取miR-26b，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-26b促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞凋亡，探究miR-26b促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。通過以上研究，

4、為進(jìn)一步闡明卵泡閉鎖的分子機(jī)理，尤其是miRNA對卵泡閉鎖的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。
　　 綜合本論文的研究結(jié)果，主要得出以下結(jié)論:
　　 (1)卵泡閉鎖的特征與判斷方法
　　 豬卵泡閉鎖的本質(zhì)是顆粒細(xì)胞的凋亡，豬卵泡閉鎖過程中近腔顆粒細(xì)胞先發(fā)生凋亡，逐漸向基膜發(fā)展。凋亡的顆粒細(xì)胞大量脫落進(jìn)入卵泡液，導(dǎo)致卵泡液顆粒細(xì)胞密度劇增。同時(shí)，卵泡閉鎖過程中卵泡液內(nèi)P/E比值顯著升高。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，健康卵泡、早期閉鎖卵泡、晚

5、期閉鎖卵泡的顆粒細(xì)胞密度分別為＜10、10～30、＞30;P/E比值分別為＜5、5～10、＞10。三個(gè)指標(biāo)在總體上對卵泡閉鎖程度的判斷趨于一致，建議采用其中兩個(gè)指標(biāo)確定卵泡閉鎖程度。
　　 (2)豬3～5 mm卵泡閉鎖的凋亡通路
　　 豬3～5 mm卵泡閉鎖主要通過TRAIL和Fas L途徑。aspase-8在凋亡信號的傳遞過程中起重要中間體的作用，凋亡信號從胞外轉(zhuǎn)入胞內(nèi)后通過Caspase-8進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡。抗凋亡基因

6、XIAP在這3～5 mm卵泡顆粒細(xì)胞的抗凋亡過程中其重要作用。轉(zhuǎn)錄因子Fox O1可能參與調(diào)控凋亡通路配體基因的表達(dá)。
　　 (3)豬卵泡閉鎖過程中miRNA的表達(dá)
　　 在豬卵泡閉鎖過程中檢測了1251個(gè)成熟miRNA的表達(dá)，其中329、369、435種miRNA分別表達(dá)在健康卵泡、早期閉鎖卵泡、晚期閉鎖卵泡中。發(fā)現(xiàn)了在卵泡閉鎖過程中差異表達(dá)的miRNA近200種，我們特別關(guān)注了在卵泡閉鎖啟動階段差異表達(dá)的23種miR

7、NA，對它們進(jìn)行了靶基因及功能、通路分析后發(fā)現(xiàn)，let-7a、miR-26b等miRNA可能在細(xì)胞凋亡通路中起調(diào)控作用。
　　 (4) miR-26b調(diào)控豬顆粒細(xì)胞凋亡的機(jī)制
　　 研究發(fā)現(xiàn)miR-26b在卵泡閉鎖過程中表達(dá)上調(diào)，miR-26b能在體外誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞的凋亡，并證明在豬顆粒細(xì)胞中，ATM是miR-26b的直接靶基因，miR-26b過表達(dá)的顆粒細(xì)胞中DNA損傷顯著增加，從而推測:miR-26b通過靶向ATM基

8、因，影響DNA損傷的修復(fù)，增加DNA損傷，從而促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡。
　　 本論文研究了豬卵泡閉鎖的生理生化特征，確定了豬3～5 mm卵泡閉鎖過程中細(xì)胞凋亡的通路，發(fā)現(xiàn)了300～500個(gè)表達(dá)于豬卵泡的miRNA，篩選出近200種在卵泡閉鎖過程中差異表達(dá)的miRNA，闡明了miR-26b促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。miRNA在卵泡閉鎖過程中的作用的相關(guān)研究是對miRNA功能的拓展，同時(shí)也有助于卵泡閉鎖分子調(diào)控機(jī)理的闡明，是將表觀遺傳