高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈酶聯(lián)免疫吸附測定方法研究.pdf

1、酶聯(lián)免疫技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測中得到廣泛應(yīng)用，本課題開展了高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈酶聯(lián)免疫吸附測定方法的研究，主要內(nèi)容包括高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈半抗原的設(shè)計(jì)、人工抗原的合成、多克隆抗體制備和相應(yīng)的ELISA檢測方法的建立，同時(shí)還用優(yōu)化后的ELISA法對高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈在樣品中進(jìn)行了添加回收檢測。
　　 通過對高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈分子進(jìn)行改造，以高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈水解后分別得到高效氟吡甲禾靈的半

2、抗原GHs和精吡氟禾草靈的半抗原JHs，再分別將半抗原GHs和JHs與四氨基丁酸反應(yīng)制得高效氟吡甲禾靈的接臂半抗原GHj和精吡氟禾草靈的接臂半抗原JHj。經(jīng)質(zhì)譜、核磁共振確證了四個(gè)半抗原的結(jié)構(gòu)。采用碳二亞胺法將半抗原和牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制備了免疫抗原，采用混合酸酐法將半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備了包被抗原，經(jīng)紫外光譜分析證明成功地合成了免疫和包被所需的人工抗原。用免疫原免疫新西蘭大白兔后，分別獲得了高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草

3、靈的特異性抗血清，用辛酸-硫酸銨法分離純化抗血清，冷凍干燥后獲得兩者的多克隆抗體。通過同源異源分析后，GHs-OVA作為包被原，GHs-Ab作為抗體對高效氟吡甲禾靈測定的靈敏度最高；JHs-OVA作為包被原，JHs-Ab作為抗體對精吡氟禾草靈測定的靈敏度最高。進(jìn)一步研究了有機(jī)溶劑、pH值和離子強(qiáng)度在間接競爭ELISA法中對高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈ELISA法檢測靈敏度的影響，確定了20％的甲醇含量和pH7.5和0.3mol/L的離子

4、強(qiáng)度的磷酸鹽緩沖溶液為高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法的最佳工作條件。
　　 利用篩選出來的抗體和抗原，在優(yōu)化的條件下，得到了高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線.高效氟吡甲禾靈在0.00190-0.926mg/mL的范圍內(nèi)保持一定的線性，線性回歸方程％B/B0＝-29.765logC＋9.0044(R2＝0.9927)，IC50為0.0419mg/L，最低檢測限(IC10

5、)為0.00190mg/L。制備的抗體對其他芳氧苯氧基丙酸酯類除草劑沒有明顯交叉反應(yīng)。精吡氟禾草靈間接競爭ELISA的回歸曲線為線性回歸方程％B/B0=-20.506logC+44.724(R2=0.9969),IC50為0.553mg/L，最低檢測限(IC10)為0.00620mg/L，線性檢測范圍在0.00620-49.358mg/L。該方法有著較好的特異性，對其他芳氧苯氧基丙酸酯類除草劑沒有明顯的交叉反應(yīng)。
　　 以建立的

6、ic-ELISA方法進(jìn)行樣品的添加回收實(shí)驗(yàn)。對高效氟吡甲禾靈進(jìn)行了水、土壤、黃瓜、甘藍(lán)、番茄、大豆、馬鈴薯中的平均添加回收實(shí)驗(yàn)，高效氟吡甲禾靈的平均添加回收率為87.43～111.80％，變異系數(shù)為0.11～12.56％。對精吡氟禾草靈進(jìn)行了水中和土壤里的添加回收實(shí)驗(yàn)，平均添加回收率為86.80～103.41％，變異系數(shù)為3.96～12.32％。表明本研究建立的高效氟吡甲禾靈和精吡氟禾草靈得ELISA方法符合農(nóng)藥殘留分析的要求。