酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法

1、酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法 測定血清中甲胎蛋白含量,臨床八年1205班2組 陳旭 陳楷 李皓,,一、實驗目的,,,,,,1 掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）的原理,2 熟悉酶聯(lián)免疫吸附實驗的操作方法,,,二、實驗原理,基礎知識 1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者Van Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫

2、測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。ELISA現(xiàn)在已成為目前分析化學領域中的前沿課題 ，它是一種特殊的試劑分析方法，是在免疫酶技術( immunoenzymatic techniques ) 的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術。,,,,甲胎蛋白（α fetoprotein，AFP） 一種含4%碳水化合物的單鏈糖蛋白，分子量70KD

3、，半衰期 5天，由592 個氨基酸殘基的單肽鏈組成?；蛭挥诘?對染色體4q1124q21區(qū)域，由 15 個外顯子和14個內(nèi)含子組成，屬于血清中一種α球蛋白，是一種胚胎性相關蛋白。自1963年發(fā)現(xiàn)以來，作為一種腫瘤特異性抗原已廣泛應用于臨床。它對原發(fā)性肝癌的早期診斷具有重要意義，同時對肝細胞癌的鑒別診斷，流行病學調(diào)查和理論研究都很有價值。,,,原理一 ELISA的基礎是抗原（或抗體）的固相化及抗原（或抗體）的酶標記。結(jié)合在固

4、相載體表面的抗原（或抗體）仍保持其免疫學活性。原理二 抗原(或抗體)可通過共價鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學和酶學活性。原理三 固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。,,,ELISA的三條

5、基本原理,雙抗體夾心法,方法 用已知抗體包被，加入待測抗原，再加酶標抗體，加底物顯色。 固相(包被)抗體Ab + 樣品(抗原Ag) + 酶標抗體Ab * → Ab-Ag-Ab* + 底物(TMB)→顯色應用 這種方法欲測的抗原必須有兩個可以與抗體結(jié)合的部位，因為其一端要與包被于固相載體上的抗體作用，而另一端則要與酶標記特異性抗體作用。,,,雙抗體夾心法圖示,,,三、實驗儀器&試劑,,,儀器 全自動酶

6、標儀、全自動酶標洗板機,試劑 待測血清、抗-AFP-L3 抗體、封閉蛋白溶液、辣根過氧化物酶（HRP）、底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB)、顯色液、終止液……OR: 甲胎蛋白（AFP）定量測定試劑盒（酶聯(lián)免疫法）,,,四、實驗步驟,,,獲得AFP未標定抗體,將AFP抗體與固相載體連接形成固相抗體,,,洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì),,加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結(jié)合位點,,洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白,,加血清形成固相抗

7、體－抗原復合物,,洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì),,加HRP酶標抗體生成抗體—待測抗原—酶標記抗體的復合物,,徹底洗滌未結(jié)合 的HRP酶標抗體,,加底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)進行酶催化反應,根據(jù)顏色反應的程度進行AFP的定量測定,,,,詳細步驟,,,1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10 孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μ

8、l 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉，再各取50μl 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六中各取50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μ，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取

9、50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為（1800ng/L ，1200ng/L，600ng/L，300ng/L， 150ng/L）。,2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育

10、30 分鐘。4. 配液：將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。7. 溫育：操作同3。8. 洗滌：操作同5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 分鐘.10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立

11、轉(zhuǎn)黃色）。11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進行。,,,辣根過氧化物酶(HRP),,,常用底物：(1)鄰苯二胺(OPD)：反應顯橙黃色，應避光，致癌性。(2)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：TMB是一種脂溶性較強的基團，由于這種高度的脂溶性，使其易形成多聚體，在HRP活性部位產(chǎn)生粗大的、深藍色沉淀物反應后呈藍色。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物

12、由藍色呈黃色，最適吸收波長為 450nm。,五、結(jié)果分析,以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。,,,六、思考題,試驗中哪些因素可能會對實驗結(jié)果造成影響？,,,（一）固相載體（二）抗原 （三）試驗樣品 （四）

13、結(jié)合物 (五）洗滌劑與稀釋劑（六）底物 （七）作用時間 (八)試驗的重復性（精確度） （九）對使用儀器要求,六、應用,,,檢查抗原半抗原1.內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等2.在血液學方面可用于檢查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、紅細胞抗原及結(jié)合球蛋白（Hapto Globin）等 檢查抗體1.在寄生蟲病方面，它用于對瘧原蟲、阿米巴、利日曼原蟲、錐蟲、血吸蟲、