水稻OsGBP轉(zhuǎn)錄因子家族基因的功能研究及雌雄配子不育基因MFS的定位與功能分析.pdf

1、轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制是真核生物基因表達(dá)中的重要調(diào)節(jié)方式，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆和抗病響應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及次生代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor)，也稱反式作用因子，它作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主體，在植物基因組中大量存在，并參與了植物的眾多生物學(xué)過程。GAGA-binding protein(GBP)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，能特異地與GAGA重復(fù)序列結(jié)合而調(diào)控下游基因的表達(dá)。本研究通過生物信息學(xué)方法，從全基因組水

2、平上對(duì)水稻OsGBP基因家族進(jìn)行了鑒定以及對(duì)該家族進(jìn)行進(jìn)化分析;通過轉(zhuǎn)基因方法，對(duì)其水稻家族基因的功能進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下:
　　1.水稻基因組中OsGBP家族含4個(gè)同源基因，系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化分析表明該家族被劃分為兩個(gè)亞類，其中OsGBP1屬于第一亞類，而OsGBP2、OsGBP3、OsGBP4屬于第二個(gè)亞類，并且串聯(lián)分布在第10染色體上?；蛳嗨菩苑治霭l(fā)現(xiàn)OsGBP1同其它基因最高相似度為53％，其它三個(gè)基因相似度在82％以上，

3、并且OsGBP2與OsGBP3是兩個(gè)相同拷貝的基因;氨基酸序列分析顯示OsGBP家族的蛋白在C端含有一個(gè)非常保守的鋅指類的DNA-binding結(jié)構(gòu)域，而在N端，兩亞類的基因存在結(jié)構(gòu)差異，其中OsGBP1含有一個(gè)介導(dǎo)蛋白之間互作的Coiled-coil的結(jié)構(gòu)域，而另外三個(gè)蛋白含有一個(gè)未知功能的保守結(jié)構(gòu)域;基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)OsGBP1和OsGBP2/3均是組成性表達(dá)，在小穗中表達(dá)較高，而OsGBP4未檢測(cè)到表達(dá);蛋白亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)Os

4、GBP1和OsGBP3均定位在細(xì)胞核，并且具有轉(zhuǎn)錄激活活性。另外，OsGBP1在禾本科植物中具有很強(qiáng)的共線性，說明在進(jìn)化中該基因可能具有非常重要的作用。
　　2.通過獲得的osgbp1突變體，以及構(gòu)建OsGBP1超量表達(dá)和抑制轉(zhuǎn)基因材料研究OsGBP1的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)OsGBP1通過影響粒型相關(guān)基因的表達(dá)負(fù)調(diào)控粒長(zhǎng)，而且OsGBP1還負(fù)調(diào)控幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。超量表達(dá)OsGBP1，幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，苗高變矮，葉片變黃，苗期生物

5、量也相應(yīng)降低;而抑制或者突變?cè)摶?，苗高增加，生物量也增?同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，將OsGBP1超量表達(dá)以后，延遲水稻的開花，株高也受到了抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，OsGBP1主要通過上調(diào)開花調(diào)控基因Ghd8，OsLFL1的表達(dá)，抑制下游Ehd、Hd3a及RFT1的表達(dá)而延遲開花。通過體內(nèi)酵母單雜交以及體外EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OsGBP1能直接結(jié)合到OsLFL1、Ghd8以及Hd3a啟動(dòng)子上的GAGA重復(fù)元件上，因此推測(cè)OsGBP1影響開花可能不是簡(jiǎn)單

6、的上下游調(diào)控的關(guān)系，而是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過程。
　　3.構(gòu)建了OsGBP3抑制和超量表達(dá)材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsGBP3不影響水稻幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，但影響株高，并且能正調(diào)控粒長(zhǎng)，促進(jìn)粒型相關(guān)基因的表達(dá)。在OsGBP3的超量表達(dá)材料中，粒長(zhǎng)、粒寬以及株高較野生型明顯增加，而在抑制材料中，粒長(zhǎng)、株高較野生型明顯降低，而粒寬不受影響。
　　4.為了研究OsGBP家族基因之間是否存在功能分化，構(gòu)建了OsGBP1和OsGBP3的雙抑制材料，該

7、材料以日本晴為背景。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雙抑制材料的粒長(zhǎng)相比野生型沒有顯著差異，而粒寬顯著降低，由此說明OsGBP家族基因在粒長(zhǎng)調(diào)控上存在拮抗作用，而在粒寬的調(diào)控上，存在功能冗余。另外，雙抑制的株高較OsGBP3單抑制顯著降低，而OsGBP1單抑制卻并不影響株高。
　　5.在研究OsGBP1時(shí)，從韓國(guó)突變體庫中獲取一份位于OsGBP1基因3'UTR區(qū)的T-DNA插入突變體，該突變體雌雄配子均不育，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)控制雌雄配子不育的位點(diǎn)與T-DNA

8、插入不共分離，但該位點(diǎn)與T-DNA連鎖，因此將其命名為MFS。
　　6.將MFS雜合突變體與廣親和材料Dular進(jìn)行雜交構(gòu)建F2群體，最終將MFS精細(xì)定位在68kb的區(qū)段里，該區(qū)段包含10個(gè)基因，分別依次將其命名為GR1-GR10。通過對(duì)可育和不育材料區(qū)間內(nèi)的基因比較測(cè)序發(fā)現(xiàn)在GR3基因的內(nèi)含子區(qū)存在一個(gè)點(diǎn)突變，該點(diǎn)突變導(dǎo)致GR3蛋白因內(nèi)含子剪切異常而發(fā)生移碼，導(dǎo)致翻譯的蛋白提前終止。
　　7.通過遺傳互補(bǔ)及對(duì)GR3基因的敲