siRNA對PRRSV非結構蛋白nsplα和nsp11表達的抑制作用研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS），又稱藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種持續(xù)或間歇性出現的一種重度疾病。PRRSV的ORF1a，ORF1b分別編碼非結構聚合蛋白pp1a以及pp1ab。隨著基因組mRNA合成以上這兩種蛋白質，pp1a和pp1ab被ORF1a編碼的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶(PCP)(nsp1)、3C-半胱氨酸蛋白酶(nsp

2、2)和絲氨酸蛋白酶(nsp4)裂解成14個不同功能的非結構蛋白。其中的nsp1α可抑制IκB的磷酸化，從而抑制NF-κB的激活基因，導致NF-κB的失活，進而抑制IFN-β的產生。nsp11可通過觸發(fā)dsRNA來調節(jié)PIG-1介導的信號通路抑制IFN-β的產生。
　　RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA啟動的特異性沉默機制，可抑制或關閉相關序列基因的表達，近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，RNAi技術

3、已經廣泛應用在動物傳染病的防治、癌癥、基因功能的研究等各個領域。siRNA同內切核酸以及其他蛋白一同形成RISC(RNA-induced silencing complex)。其中核酸部分可引導蛋白部分降解mRNA，阻斷靶基因翻譯成蛋白質。
　　本研究人工設計并合成PRRSV非結構蛋白nsp1α和nsp11的siRNA，將對應的siRNA分別與重組質粒pcDNA3.1-nsp1α-GFP，pcDNA3.1-nsp11-GFP共轉染

4、293T細胞，MARC-145細胞。通過熒光顯微鏡觀察細胞中nsp1α和nsp11蛋白表達量，Western Blot試驗檢測nsp1α和nsp11蛋白表達量，間接免疫熒光試驗檢測病毒在細胞中的復制，以及在MARC-145細胞中病毒TCID50的測定，揭示siRNA對PRRSV非結構蛋白nsp1α和nsp11表達的抑制效果。
　　熒光倒置顯微鏡的觀察結果顯示，靶向siRNA可抑制重組基因蛋白的表達。Western Blot結果顯示