豬肉弓形蟲檢驗(yàn)方法的研究.pdf

1、該研究首先建立豬弓形蟲抗體間接ELISA檢測(cè)方法.在試驗(yàn)中比較了三種純化弓形蟲速殖子的方法.試驗(yàn)結(jié)果顯示,植物血凝素(PHA-P)法蟲體回收率和白細(xì)胞清除率均超過(guò)98％,只有1.5％的白細(xì)胞未被清除,大大減少了ELISA抗原所致的非特異性反應(yīng),所以該研究應(yīng)用植物血凝素法純化弓形蟲速殖子.通過(guò)對(duì)弓形蟲速殖子純化后經(jīng)超聲波裂解的可溶性蛋白抗原進(jìn)行包被,建立間接ELISA方法檢測(cè)豬弓形蟲IgG抗體.其次建立雙重PCR檢測(cè)方法,據(jù)弓形蟲基因組B

2、1基因與529bp的重復(fù)基因片斷設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)引物,建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定的雙重PCR檢測(cè)豬弓形蟲的方法.靈敏度試驗(yàn)結(jié)果可檢測(cè)到20fg弓形蟲基因組DNA水平,結(jié)果表明此雙重PCR方法靈敏度高;特異性試驗(yàn)檢測(cè)包括雞柔嫩艾美耳球蟲、牛肉孢子蟲、豬肉孢子蟲、旋毛蟲等16種病原微生物,結(jié)果均為陰性,結(jié)果表明此雙重PCR方法特異性強(qiáng).將采自獸醫(yī)院門診及肉聯(lián)廠、屠宰場(chǎng)的511份豬血清樣品分別用建立的間接ELISA和IHAKit進(jìn)行平行檢測(cè).I

3、HAKit初步檢測(cè)獸醫(yī)院門診95份病豬及揚(yáng)州屠宰場(chǎng)151份屠豬血清樣品,陽(yáng)性及可疑的血清樣品共計(jì)49份.用DT、IHA和間接ELISA平行檢測(cè)此49份血清樣品.結(jié)果49份血清樣品中,DT檢出10份陽(yáng)性,39份陰性;DT檢出10份陽(yáng)性樣品中,IHA檢出7份陽(yáng)性;間接ELISA檢出9份陽(yáng)性;同時(shí)用免疫過(guò)氧化物酶染色方法和PCR方法對(duì)49份血清樣品對(duì)應(yīng)的組織樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果免疫過(guò)氧化物酶染色法檢出5份陽(yáng)性,PCR檢出7份陽(yáng)性.DT檢出39份

4、陰性樣品中IHA檢測(cè)出一份陽(yáng)性;間接ELISA檢測(cè)出3份陽(yáng)性;免疫過(guò)氧化物酶染色、PCR檢測(cè)全部為陰性.與DT相比,IHA試驗(yàn)的敏感性、特異性、符合率和Youden指數(shù)分別為76.92％、97.5％、91.85％和0.744;間接ELISA的敏感性、特異性、符合率和Youden指數(shù)分別為90.9％、92.85％、91.85％和0.838;免疫過(guò)氧化物酶染色法的敏感性、特異性、符合率和Youden指數(shù)分別為66.7％、100％、89.80

5、％和0.678;PCR的敏感性、特異性、符合率和Youden指數(shù)分別為76.9％、100％、93.88％和0.77.試驗(yàn)結(jié)果表明,IHA、IHC、PCR法特異性強(qiáng),但敏感性較低;間接ELISA的敏感性高、特異性強(qiáng),由Youden指數(shù)判斷此間接ELISA具有診斷價(jià)值,而且間接ELISA的陽(yáng)性率高于其它方法,可以成為一種有用的弓形蟲病診斷方法.根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,初步建立并優(yōu)化的豬弓形蟲檢測(cè)程序?yàn)?首先用IHA、間接ELISA對(duì)待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)以