弓形蟲Trx體外表達的初步研究.pdf

1、目的：
　　克隆剛地弓形蟲硫氧還原蛋白（Thioredoxin, Trx）基因，構建原核表達載體，通過誘導表達和純化蛋白，免疫家兔制備多克隆抗體。構建弓形蟲Trx的真核表達載體，使Trx基因在HepG2細胞中過表達。
　　方法：
　　采用PCR技術擴增剛地弓形蟲Trx基因，克隆至原核表達載體pET-28a（+）中，轉化大腸埃希菌（E. coli）Rosetta，用IPTG誘導目的蛋白表達，利用鎳親和層析法獲得純化蛋白，

2、同時免疫家兔制備多克隆抗體。通過Western blotting鑒定多克隆抗體的特異性。
　　構建Trx/p3XFLAG-Myc-CMV?-24真核表達載體，采用非脂質體陽離子聚合物RonfectTM將載體轉染至HepG2細胞，Western blotting技術鑒定弓形蟲Trx基因在HepG2細胞中不同時間點的表達情況。
　　結果：
　　成功從剛地弓形蟲cDNA中擴增出Trx目的基因，構建了Trx/pET-28a（+

3、）重組質粒，獲得抗Trx重組蛋白的多克隆抗體。采用Western blotting檢測出弓形蟲Trx蛋白的特異性條帶。
　　成功構建Trx/p3XFLAG-Myc-CMV?-24真核表達載體，轉染HepG2細胞24 h、48 h和72 h后，Western blotting技術在47.7 KD處檢測到均有特異性條帶出現(xiàn)，且Trx在HepG2細胞中48 h表達量最高。
　　結論：
　　制備的兔抗Trx多克隆抗體具有較高的