弓形蟲病分子診斷方法及弓形蟲分離株耐藥性的研究.pdf

1、弓形蟲病(Toxoplasmosis)是由剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的以孕婦(畜)流產(chǎn)、弱胎、畸胎、死胎和兒童(幼畜)生長受阻、死亡等為特征的人畜共患病。該病廣泛存在于世界各地，宿主范圍十分廣泛，人及大多數(shù)動物感染率都較高，是人類優(yōu)生的大敵，是當(dāng)今新生兒致畸的四大病因之一。弓形蟲病在豬場感染率高，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。建立準(zhǔn)確快速的診斷方法和研制安全高效疫苗是預(yù)防和控制弓形蟲病的重要措施。MIC3是弓形蟲在速殖

2、子、緩殖子及子孢子期都表達(dá)的粘附蛋白，與弓形蟲入侵宿主細(xì)胞密切相關(guān)，已證明其具有良好的免疫原性。本研究利用原核表達(dá)的弓形蟲微線體蛋白3(MIC3)建立了SPA-ELISA和AG-ELISA檢測方法，利用細(xì)胞培養(yǎng)方法從臨床血清學(xué)陽性的病料中分離得到了10株弓形蟲蟲株，并對蟲株的耐藥性進(jìn)行了研究。主要研究成果如下： 本研究利用本室構(gòu)建的pGEX-KG-MIC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，確定了pGEX-KG-MIC3在E.coliBL21-

3、CodonPlus菌株中高效表達(dá)的最佳條件，SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)表明表達(dá)的融合蛋白分子量為66KD，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Westernblot檢測證實(shí)具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)原性。 利用純化的重組蛋白rMIC3替代傳統(tǒng)的蟲體成份作為診斷抗原建立了SPA-ELISA和AG-ELISA診斷方法。這兩種方法檢測豬其它常見病原體陽性血清，結(jié)果全為陰性；SPA-ELISA和AG-ELISA分別能檢測到1:6400和1:12800稀釋血清中的抗T.gond

4、ii特異性抗體；診斷試劑的批內(nèi)(間)重復(fù)試驗(yàn)，ELISA變異系數(shù)<10％；在4℃貯存下診斷試劑的保質(zhì)期均超過8個(gè)月。結(jié)果表明，本研究建立的兩種診斷方法均具有良好的特異性、敏感性、穩(wěn)定性及較長的保質(zhì)期。 為驗(yàn)證和比較SPA-ELISA和AG-ELISA的廣適性，在臨床上，檢測了四種不同動物血清，共332份，并與MAT方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，除山羊血清外，SPA-ELISA對豬、犬、貓血清的陽性檢出率均高于MAT方法，二者符合率超

5、過90％。利用AG-ELISA檢測四種動物血清，共304份，并與MAT方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，AG-ELISA對四種動物血清的陽性檢出率均高于MAT方法。說明了AG-ELISA具有更廣泛的宿主適用范圍。 為進(jìn)一步驗(yàn)證AG-ELISA的實(shí)際應(yīng)用效果，利用已建立的AG-ELISA監(jiān)測了人工感染弓形蟲豬體內(nèi)抗體水平的動態(tài)變化，同時(shí)用MAT方法及ELISAkit平行測定。結(jié)果表明，首次感染第10d，8頭人工感染豬的AG-ELISA抗體均

6、為陽性，第35d，AG-ELISA抗體水平達(dá)到高峰，隨后緩慢下降，在第57d時(shí)仍可檢測到ELISA抗體。Kappa一致性試驗(yàn)結(jié)果表明，AG-ELISA與MAT方法及ELISAkit符合良好。 為提高弓形蟲細(xì)胞分離的陽性率，對細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)的最佳條件為選用DMEM高糖培養(yǎng)基，加入1％血清和10％SRC。采集豬的抗凝全血，利用細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行了弓形蟲蟲株的分離。利用上述培養(yǎng)條件，對19份弓形蟲AG-ELI

7、SA抗體陽性的抗凝血進(jìn)行了弓形蟲蟲株的分離培養(yǎng)，經(jīng)顯微鏡觀察、PCR檢測以及動物接種試驗(yàn)證明，成功地分離得到10株弓形蟲分離株。耐藥性試驗(yàn)初步顯示其中的一株對磺胺類藥物具有一定的抗藥性。 本研究建立的SPA-ELISA和AG-ELISA診斷方法，解決了目前弓形蟲病不易快速、準(zhǔn)確、簡便診斷的難題，對多種動物弓形蟲病的臨床診斷、疾病控制等均具有重要意義。豬源弓形蟲蟲株的分離及磺胺耐藥現(xiàn)象的初步證實(shí)，為弓形蟲病的有效防治及合理用藥奠定