狂犬病毒膠體金試紙條的制備和雜交瘤細(xì)胞株的免疫加強(qiáng).pdf

1、狂犬病是一種常見(jiàn)的人獸共患病,是由于狂犬病毒感染造成的?？袢【哂泻軓?qiáng)的潛伏性,很多攜帶狂犬病毒的動(dòng)物并不表現(xiàn)出患病癥狀,這對(duì)狂犬病的及早發(fā)現(xiàn)和預(yù)防造成了非常大的困難。本實(shí)驗(yàn)旨在制備方便快捷并且具有高效性特異性的狂犬病毒膠體金免疫檢測(cè)試紙條,使檢測(cè)狂犬病的潛在病源更加方便,從而使狂犬病從傳染源上得到更好的控制。本論文的前半部分就對(duì)膠體金試紙條的研制進(jìn)行了初步的研究和探索。
　　 在制備單克隆抗體雜交瘤時(shí),常常因?yàn)榕囵B(yǎng)條件的改變、

2、傳代次數(shù)的增加以及凍存和解凍等對(duì)雜交瘤造成一定的影響,使雜交瘤分泌抗體的能力減弱甚至消失,而只能重新制備雜交瘤或者選取其他的雜交瘤,這就對(duì)實(shí)驗(yàn)周期和實(shí)驗(yàn)的一致性造成了影響。而通過(guò)體外致敏淋巴細(xì)胞可以快速獲得能夠分泌抗體的免疫細(xì)胞,如果能夠?qū)⒉荒芊置诳贵w的雜交瘤通過(guò)體外免疫手段重新刺激,使其能夠重新獲得或者提高分泌抗體的能力,那么將大大縮短實(shí)驗(yàn)周期、提高實(shí)驗(yàn)的效率,本論文的后半部分就對(duì)雜交瘤進(jìn)行體外致敏的方法進(jìn)行了初步的研究。
　　

3、 一單雜交瘤的選擇和抗體純化
　　 本試驗(yàn)首先通過(guò)有限稀釋ELISA和夾心ELISA法分別測(cè)定了7株本實(shí)驗(yàn)室制備的單克隆抗體雜交瘤所產(chǎn)生的單抗的相對(duì)親和力和識(shí)別抗原表位,并發(fā)現(xiàn)雜交瘤17E3所分泌的單克隆抗體有最強(qiáng)的結(jié)合力,而雜交瘤17F3與1782、17E3以及17E4識(shí)別的抗原表位最遠(yuǎn),17E3與1782、17E4所識(shí)別的抗原表位最近。然后選擇17E3、17B2和17F3三株雜交瘤,對(duì)石蠟油處理的Balb/c小鼠進(jìn)行腹腔注

4、射,制備了具有免疫效價(jià)的腹水,并經(jīng)過(guò)辛酸.硫酸銨法對(duì)腹水進(jìn)行了IgG亞型抗體的純化,分別得到了濃度為1.88mg/mL的17E3單克隆抗體和濃度為1.51mg/mL的混合抗體(17B2和17F3);經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在50kD和25KD處有明顯的條帶出現(xiàn),說(shuō)明純化得到的蛋白是IgG型抗體,并且具有較高的純度,能夠滿足進(jìn)一步試驗(yàn)的要求。
　　 二膠體金的制備
　　 采用檸檬酸三鈉還原法制備顆粒大小為20-30nm

5、的膠體金。制備得到的膠體金呈現(xiàn)酒紅色,并且在4℃和室溫下存放一個(gè)月都未發(fā)生凝集沉淀現(xiàn)象,說(shuō)明膠體金的金顆粒大小符合要求,在20-30nm之間,并且具有良好的穩(wěn)定性。
　　 三膠體金包被抗體
　　 將制備的單克隆抗體用膠體金包被,用于膠體金試紙條結(jié)合墊的制備。首先需要確定穩(wěn)定膠體金的最小蛋白濃度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出每200μL的膠體金加入4μL的4倍稀釋純化17E3單克隆抗體IgG,能使其在添加40μL10％的NaCl作用下保持

6、穩(wěn)定,不發(fā)生凝集,所以在包被膠體金的時(shí)候應(yīng)選擇最小穩(wěn)定量的120％,即每毫升24μL的4倍稀釋17E3單克隆抗體。
　　 膠體金標(biāo)記抗體的穩(wěn)定性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在4℃保存1周以上的金標(biāo)抗體未發(fā)生凝聚,說(shuō)明制備的金標(biāo)抗體穩(wěn)定性良好。
　　 四金標(biāo)抗體試紙條的制作
　　 金標(biāo)抗體試紙條包括滴加樣品的樣品墊、樣品與金標(biāo)抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合墊、用于檢測(cè)樣品是否帶有抗原的檢測(cè)墊以及吸水墊四部分構(gòu)成。實(shí)驗(yàn)中首先對(duì)制作樣品墊、

7、結(jié)合墊以及檢測(cè)墊的材料進(jìn)行了篩選,Ahlstrom8964玻璃纖維板對(duì)金標(biāo)抗體的干燥最適合,能夠結(jié)合大量的膠體金,而且凝固后顏色較為均勻,可以保證在層析時(shí)金顆粒在硝酸纖維素膜上均勻擴(kuò)散。對(duì)于檢測(cè)墊,選擇層析速度適中的Millipore135、Immunopore FP或者Prima40。
　　 其次,經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn),以pH9.0含0.2％ Tween-20 Tris-HCl緩沖液包被樣品墊是最理想的,將膠體金以1∶2比例稀釋后包被

8、結(jié)合墊能夠產(chǎn)生可見(jiàn)的沉淀線和較輕的背景色?；旌峡贵w包被檢測(cè)線可以在陽(yáng)性測(cè)試中顯示出沉淀線,而在陰性測(cè)試中不產(chǎn)生沉淀線,但是質(zhì)控線無(wú)論在陽(yáng)性測(cè)試還是陰性測(cè)試中都不會(huì)產(chǎn)生沉淀,這可能是由于包被質(zhì)控線所使用的羊抗鼠IgG的濃度不足或者效價(jià)不高造成的。
　　 五雜交瘤的體外致敏
　　 試驗(yàn)選取分泌單克隆抗體能力減弱的雜交瘤作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)添加胸腺細(xì)胞條件培養(yǎng)液,使雜交瘤、雜交瘤+脾細(xì)胞、脾細(xì)胞分別與不同梯度的狂犬病疫苗抗原作用