狂犬病毒膠體金試紙條的制備和雜交瘤細胞株的免疫加強.pdf

1、狂犬病是一種常見的人獸共患病,是由于狂犬病毒感染造成的?？袢【哂泻軓姷臐摲?很多攜帶狂犬病毒的動物并不表現(xiàn)出患病癥狀,這對狂犬病的及早發(fā)現(xiàn)和預(yù)防造成了非常大的困難。本實驗旨在制備方便快捷并且具有高效性特異性的狂犬病毒膠體金免疫檢測試紙條,使檢測狂犬病的潛在病源更加方便,從而使狂犬病從傳染源上得到更好的控制。本論文的前半部分就對膠體金試紙條的研制進行了初步的研究和探索。
　　 在制備單克隆抗體雜交瘤時,常常因為培養(yǎng)條件的改變、

2、傳代次數(shù)的增加以及凍存和解凍等對雜交瘤造成一定的影響,使雜交瘤分泌抗體的能力減弱甚至消失,而只能重新制備雜交瘤或者選取其他的雜交瘤,這就對實驗周期和實驗的一致性造成了影響。而通過體外致敏淋巴細胞可以快速獲得能夠分泌抗體的免疫細胞,如果能夠?qū)⒉荒芊置诳贵w的雜交瘤通過體外免疫手段重新刺激,使其能夠重新獲得或者提高分泌抗體的能力,那么將大大縮短實驗周期、提高實驗的效率,本論文的后半部分就對雜交瘤進行體外致敏的方法進行了初步的研究。
　　

3、 一單雜交瘤的選擇和抗體純化
　　 本試驗首先通過有限稀釋ELISA和夾心ELISA法分別測定了7株本實驗室制備的單克隆抗體雜交瘤所產(chǎn)生的單抗的相對親和力和識別抗原表位,并發(fā)現(xiàn)雜交瘤17E3所分泌的單克隆抗體有最強的結(jié)合力,而雜交瘤17F3與1782、17E3以及17E4識別的抗原表位最遠,17E3與1782、17E4所識別的抗原表位最近。然后選擇17E3、17B2和17F3三株雜交瘤,對石蠟油處理的Balb/c小鼠進行腹腔注

4、射,制備了具有免疫效價的腹水,并經(jīng)過辛酸.硫酸銨法對腹水進行了IgG亞型抗體的純化,分別得到了濃度為1.88mg/mL的17E3單克隆抗體和濃度為1.51mg/mL的混合抗體(17B2和17F3);經(jīng)SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn),在50kD和25KD處有明顯的條帶出現(xiàn),說明純化得到的蛋白是IgG型抗體,并且具有較高的純度,能夠滿足進一步試驗的要求。
　　 二膠體金的制備
　　 采用檸檬酸三鈉還原法制備顆粒大小為20-30nm

5、的膠體金。制備得到的膠體金呈現(xiàn)酒紅色,并且在4℃和室溫下存放一個月都未發(fā)生凝集沉淀現(xiàn)象,說明膠體金的金顆粒大小符合要求,在20-30nm之間,并且具有良好的穩(wěn)定性。
　　 三膠體金包被抗體
　　 將制備的單克隆抗體用膠體金包被,用于膠體金試紙條結(jié)合墊的制備。首先需要確定穩(wěn)定膠體金的最小蛋白濃度。通過實驗得出每200μL的膠體金加入4μL的4倍稀釋純化17E3單克隆抗體IgG,能使其在添加40μL10％的NaCl作用下保持

6、穩(wěn)定,不發(fā)生凝集,所以在包被膠體金的時候應(yīng)選擇最小穩(wěn)定量的120％,即每毫升24μL的4倍稀釋17E3單克隆抗體。
　　 膠體金標記抗體的穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn),在4℃保存1周以上的金標抗體未發(fā)生凝聚,說明制備的金標抗體穩(wěn)定性良好。
　　 四金標抗體試紙條的制作
　　 金標抗體試紙條包括滴加樣品的樣品墊、樣品與金標抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合墊、用于檢測樣品是否帶有抗原的檢測墊以及吸水墊四部分構(gòu)成。實驗中首先對制作樣品墊、

7、結(jié)合墊以及檢測墊的材料進行了篩選,Ahlstrom8964玻璃纖維板對金標抗體的干燥最適合,能夠結(jié)合大量的膠體金,而且凝固后顏色較為均勻,可以保證在層析時金顆粒在硝酸纖維素膜上均勻擴散。對于檢測墊,選擇層析速度適中的Millipore135、Immunopore FP或者Prima40。
　　 其次,經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn),以pH9.0含0.2％ Tween-20 Tris-HCl緩沖液包被樣品墊是最理想的,將膠體金以1∶2比例稀釋后包被

8、結(jié)合墊能夠產(chǎn)生可見的沉淀線和較輕的背景色?；旌峡贵w包被檢測線可以在陽性測試中顯示出沉淀線,而在陰性測試中不產(chǎn)生沉淀線,但是質(zhì)控線無論在陽性測試還是陰性測試中都不會產(chǎn)生沉淀,這可能是由于包被質(zhì)控線所使用的羊抗鼠IgG的濃度不足或者效價不高造成的。
　　 五雜交瘤的體外致敏
　　 試驗選取分泌單克隆抗體能力減弱的雜交瘤作為實驗對象,通過添加胸腺細胞條件培養(yǎng)液,使雜交瘤、雜交瘤+脾細胞、脾細胞分別與不同梯度的狂犬病疫苗抗原作用