萊克多巴胺雜交瘤細(xì)胞株的建立及其金標(biāo)快速檢測(cè)試紙的研制.pdf

1、萊克多巴胺(Ractopamine，RAC)與克侖特羅(Clenbuterol，CL)都是β2-激動(dòng)劑類違禁藥物。RAC具有廣泛的生理效應(yīng)，常被用于支氣管哮喘、支氣管痙攣和產(chǎn)科疾病的治療。動(dòng)物日糧中添加RAC能顯著提高胴體瘦肉率和飼料報(bào)酬，但是長(zhǎng)期使用會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)殘留，通過(guò)食物鏈導(dǎo)致人體中毒，表現(xiàn)為心悸、肌肉震顫、惡心嘔吐、頭昏、神經(jīng)過(guò)敏和外周血管擴(kuò)張，甚至引起死亡。另外，β2-激動(dòng)劑還有致癌、致畸、致突變作用。隨著CL等藥物被禁用，R

2、AC的非法添加日趨嚴(yán)重。RAC的檢測(cè)方法較CL等其他β2-激動(dòng)劑滯后，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)和快速檢測(cè)的要求。因此建立一種能夠快速高效、靈敏經(jīng)濟(jì)的RAC殘留檢測(cè)方法迫在眉睫。 本研究利用蛋白質(zhì)連接技術(shù)人工合成了完全抗原，通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備了抗RAC單克隆抗體，并利用膠體金免疫層析技術(shù)，采用競(jìng)爭(zhēng)法成功研制了RAC膠體金免疫層析試紙，試紙靈敏度、特異性、穩(wěn)定性等均達(dá)到檢測(cè)要求，其規(guī)?；Y選特點(diǎn)更適用于常規(guī)化檢測(cè)需要，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和極高的

3、商業(yè)開(kāi)發(fā)價(jià)值。 1.人工抗原的合成與抗RAC單克隆抗體的制備以多元酸酐與混合酸酐聯(lián)用法將半抗原RAC分別與載體牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)制成人工抗原，以RAC-BSA免疫BALB/c小鼠，以RAC-OVA作為ELISA包被抗原，應(yīng)用雜交瘤單克隆化技術(shù)獲得1株能穩(wěn)定分泌抗RAC單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株G11；用間接ELISA方法測(cè)定腹水單抗效價(jià)為1:409600t經(jīng)膠體金免疫層析實(shí)驗(yàn)(GICA)鑒定單抗與RA

4、C特異性結(jié)合；G11單抗對(duì)RAC的半數(shù)抑制濃度(IC50)為2，75ng·ml-1，除與多巴酚丁胺有9.8％的交叉反應(yīng)外，與克倫特羅、腎上腺素、去甲腎上腺素、異丙腎上腺素、苯氧丙酚胺、沙丁胺醇和多巴胺的交叉反應(yīng)性都小于0.03％；該細(xì)胞株體外多次傳代培養(yǎng)和反復(fù)凍存復(fù)蘇后抗體分泌穩(wěn)定。 2.膠體金及RAC膠體金免疫層析試紙的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備直徑20nm左右的膠體金并標(biāo)記單抗作為檢測(cè)試劑，單抗加入量為7.2μg·ml-1

5、，標(biāo)記pH控制在8.2左右，以1％PEG20000作穩(wěn)定劑。采用國(guó)產(chǎn)上海金標(biāo)SB-06玻璃纖維膜作為金標(biāo)抗體吸附材料，Sartorius CN-140硝酸纖維素膜作為層析材料制成試紙。抗原和二抗包被濃度分別為1mg·ml-1(1μ l·cm-1)、2mg·ml-1(1μ1·cm-1)，金標(biāo)單抗按1:3稀釋后噴布于玻璃纖維膜上，1m1/墊(50mm×60mm)。膠體金免疫層析試紙條的檢測(cè)靈敏度為5ng·ml-1，在室溫干燥條件下可保存12