蛋氨酸、賴氨酸二肽對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳機(jī)能的影響.pdf

1、產(chǎn)奶量低和乳品質(zhì)低一直是制約我國奶牛業(yè)發(fā)展的重要因素，加大泌乳調(diào)控機(jī)理研究對我國奶牛業(yè)發(fā)展具有重要的理論價值和應(yīng)用價值。氨基酸是乳蛋白合成的重要底物，然而隨著氨基酸營養(yǎng)研究的深入，許多學(xué)者們發(fā)現(xiàn)血液循環(huán)中的肽不僅參與乳腺細(xì)胞中氨基酸的合理供應(yīng)和乳蛋白的合成，還彌補(bǔ)了乳腺組織對游離氨基酸攝入的不足。近年來有關(guān)小肽營養(yǎng)的研究主要側(cè)重于日糧中添加小肽對奶牛生產(chǎn)性能影響，而關(guān)于小肽對體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞(DCMECs)泌乳機(jī)理及調(diào)控機(jī)制等

2、方面的研究較少。SND1基因是重要的轉(zhuǎn)錄共激活子，而在DCMECs中的報道還較少。研究小肽營養(yǎng)與乳蛋白合成、乳腺泌乳能力的關(guān)系以及小肽與功能基因的互作關(guān)系將有助于揭示乳蛋白合成的調(diào)控機(jī)制。
　　 本試驗(yàn)成功構(gòu)建體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞模型，添加不同濃度的蛋氨酸-蛋氨酸、賴氨酸-賴氨酸、蛋氨酸-賴氨酸以及賴氨酸-蛋氨酸二肽，應(yīng)用CASY細(xì)胞活力分析儀檢測體外培養(yǎng)的DCMECs的活力及增殖能力;運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR檢測四種二肽對

3、β-酪蛋白mRNA表達(dá)水平的影響，確定四種二肽的最佳添加濃度，并進(jìn)一步通過Western blot分析添加最佳濃度時泌乳相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞染色法檢測SND1、PepT2、STAT5a和p-STAT5a在DCMECs內(nèi)定位情況，對SND1進(jìn)行基因沉寂和超表達(dá)，通過檢測細(xì)胞的活力、增殖能力、mRNA表達(dá)以及蛋白表達(dá)確定其在泌乳信號通路中的作用。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)24h時四種二肽的最佳添加濃度分別為80μg/

4、ml，100μg/ml，50μg/ml，80μg/ml。定位發(fā)現(xiàn)SND1在DCMECs的細(xì)胞核和胞質(zhì)中都有分布，且主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，少量在胞質(zhì)中存在;PepT2主要在細(xì)胞核周圍分布，在細(xì)胞核內(nèi)分布較少，細(xì)胞形態(tài)清晰可見;STAT5a和p-STAT5a在細(xì)胞核內(nèi)及胞質(zhì)中均有表達(dá)。SND1的干擾實(shí)驗(yàn)表明最佳的siRNA oligo濃度為25 nmol/mL; SND1干擾后三個基因mRNA表達(dá)均與陰性對照組差異顯著，SND1干擾+MK組與

5、SND1干擾組相比，SND1表達(dá)無顯著差異，而STAT5a和β-casein表達(dá)差異顯著;干擾SND1后，相關(guān)蛋白與對照組相比，差異顯著(P＜0.05)，除PepT2與對照組無顯著差異，添加MK后，蛋白的表達(dá)量并沒有顯著提高。SND1的超表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染24h時細(xì)胞活力及增殖能力與未轉(zhuǎn)染組相比差異顯著(P＜0.05)，添加MK后細(xì)胞活力及增殖能力有所提高;SND1超表達(dá)后三個基因mRNA表達(dá)均與空載體組差異顯著(P＜0.05);瞬時轉(zhuǎn)染