酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、背景與目的：
　　酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是長期過量飲酒所致的肝損傷，包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝硬化三種主要病理類型。隨著人們飲酒量的增加，ALD的發(fā)病率有逐年增長趨勢。2011年美國男性和女性ALD的患病率分別為7.4％、4.0％。ALD在俄國的發(fā)生率約為5％。我國雖然缺乏大規(guī)模的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，但據(jù)統(tǒng)計(jì)，ALD已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。2000年浙江省ALD流行病

2、學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，人群患病率為4.34％。
　　ALD是一種遺傳-行為-環(huán)境相互作用的慢性疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，包括乙醇及其衍生物的代謝、營養(yǎng)失衡、免疫因素、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺氧、炎癥介質(zhì)、自噬與凋亡、基因多態(tài)性、microRNA和表觀遺傳學(xué)等。但這些詮釋尚未涵蓋所有的發(fā)病機(jī)制，ALD發(fā)生發(fā)展過程中復(fù)雜的分子事件直接導(dǎo)致了各種針對ALD的治療措施收效不顯。因此，深入研究其發(fā)病機(jī)制對指導(dǎo)本病的防治和提高患者的生活質(zhì)量意義深遠(yuǎn)。<

3、br>　　本實(shí)驗(yàn)在成功構(gòu)建ALD動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，分析了ALD發(fā)生發(fā)展過程中肝臟基因和蛋白質(zhì)表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)變化，以期為認(rèn)識(shí)ALD發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新線索。
　　方法：
　　首先，用酒精給大鼠連續(xù)灌胃1月和3月，觀察肝臟病理變化。其次，采用基因芯片技術(shù)，對酒精性脂肪肝組、酒精性肝炎組和正常對照組大鼠肝臟基因表達(dá)變化進(jìn)行兩兩比較分析，并應(yīng)用分子注釋系統(tǒng)(MAS)進(jìn)行基因本體(GO)功能注釋和Pathway(KEGG和GenMAPP)

4、分析。第三，應(yīng)用雙向熒光差異凝膠電泳(2D DIGE)技術(shù)分析不同病理狀態(tài)的模型組和對照組大鼠肝臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異，所得到的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/TOF)進(jìn)行檢測以鑒定差異蛋白，并結(jié)合生物信息學(xué)手段對差異蛋白進(jìn)行功能分析和相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。
　　結(jié)果：
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到了肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤、壞死，與人類酒精性脂肪肝和酒精性肝炎的病理表現(xiàn)相似。
　　基因組學(xué)研究方面，分別篩選出顯著差異表

5、達(dá)的基因285個(gè)（酒精性脂肪肝組與正常對照組比較）、318個(gè)（酒精性肝炎組和正常對照組比較）。兩種病理狀態(tài)的大鼠在肝臟基因的表達(dá)上無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些差異基因主要參與了氧化還原、各種代謝（包括脂質(zhì)、乙酰輔酶A、β-內(nèi)酰胺類抗生素、谷氨酸鹽、氨基酸、碳水化合物）、細(xì)胞分化及凋亡、補(bǔ)體激活等200多種生理過程和分子功能，以及近百條信號(hào)通路。通過分析及比較，發(fā)現(xiàn)了一些具有明顯階段特異性的差異基因，它們分別參與了不同的代謝途徑。H2-T3，

6、Aldh1l1，Pklr等基因在酒精性脂肪肝階段上調(diào);同階段下調(diào)的基因有:Pla2g12a，Hes1，Gcnt2，Adh4等。Coq6，Idi1，F(xiàn)dps，Ppox，Gck，Npas2，Ddhd1等基因在酒精性肝炎階段上調(diào);同階段下調(diào)的基因有:C7，Alas2，Got1，Aoc3，Vcam1，Mmp2，G6pc等。這些基因可能因作用于不同的代謝途徑而導(dǎo)致了不同的病理改變。其中，大部分基因罕見報(bào)道。值得關(guān)注的是，Pla2g12a基因參與了

7、VEGF, MAPK等多條信號(hào)通路，而MAPK信號(hào)通路又通過細(xì)胞色素P4504a8基因與PPAR信號(hào)通路有著聯(lián)系。Pla2g12a基因如何受VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，其引起酒精性脂肪肝發(fā)生的機(jī)制尚待深入研究。
　　此外，差異基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)了位于網(wǎng)絡(luò)中心的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因周期素D1(Ccnd1)。我們還從參與ALD發(fā)病機(jī)制的信號(hào)通路中選擇了PPAR、胰島素、MAPK、粘著斑和P53這5條信號(hào)通路，并挑選這些通路中的37個(gè)基

8、因進(jìn)行了熒光定量PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致。其中，脂肪酸合成酶基因(Fasn)和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A基因(Cpt1a)的表達(dá)量隨ALD病程的進(jìn)展分別持續(xù)增強(qiáng)和減弱。
　　蛋白組學(xué)研究方面，共鑒定了49個(gè)差異蛋白。除去冗余蛋白，酒精性脂肪肝和酒精性肝炎兩個(gè)病理階段的差異蛋白共35個(gè)。它們分別與三大物質(zhì)的代謝、尿素合成、脂肪酸β氧化、細(xì)胞骨架、免疫防御、電子轉(zhuǎn)移、細(xì)胞交通、ATP結(jié)合、抗氧化等功能有關(guān)。其中，8個(gè)蛋白的

9、表達(dá)水平在酒精性脂肪肝和酒精性肝炎階段均明顯上調(diào)，分別是:碳酸酐酶3、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶Mu1和Mu2、衰老標(biāo)記蛋白、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白亞單位α、腺苷高半胱氨酸酶、類甘油醛-3-磷酸脫氫酶和過氧化氫酶(catalase，CAT)。而ATP合成酶亞單位d和β肌動(dòng)蛋白FE-3的表達(dá)水平在這兩階段均明顯下調(diào)。提示這些蛋白可能與ALD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。尤其是CAT，在應(yīng)用Genomatix軟件分析差異蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)后，發(fā)現(xiàn)它處于網(wǎng)絡(luò)的中心，故推測這

10、些差異蛋白可能因?yàn)橛绊懥薈AT而最終導(dǎo)致了ALD。綜合文獻(xiàn)報(bào)道，我們認(rèn)為衰老標(biāo)記蛋白可以作為診斷ALD的生物學(xué)標(biāo)志物，它可能系通過胰島素代謝途徑而影響了ALD的發(fā)生發(fā)展。另一發(fā)現(xiàn)是，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶Mu1在ALD發(fā)展過程中的表達(dá)量穩(wěn)步上升，間接反映了ALD發(fā)生發(fā)展過程中氧化應(yīng)激水平的不斷加重。
　　結(jié)論：
　　1.成功地構(gòu)建了ALD大鼠模型;
　　2.發(fā)現(xiàn)了一些階段特異性的代謝途徑和差異基因，其中Pla2g12a基因及其