紅富士蘋果離體葉片不定芽再生機(jī)理研究.pdf

1、本研究以紅富士蘋果繼代試管苗葉片為試驗材料，結(jié)合石蠟切片法對葉片離體培養(yǎng)下不定芽的形態(tài)發(fā)生進(jìn)行了較系統(tǒng)的解剖觀察，研究了不定芽的發(fā)生途徑、分化時間及起源部位等，對葉片不定芽再生過程中一系列生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測定，對比分析了光照培養(yǎng)和黑暗培養(yǎng)及培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素種類對各生理生化因子的影響，旨在探討各因子在不定芽發(fā)生過程中的作用機(jī)制，以期為葉片再生不定芽調(diào)控提供理論依據(jù)；此外，試驗還對影響葉片再生的主要因素即細(xì)胞分裂素種類及配比、暗培養(yǎng)時間

2、、碳源、繼代苗齡等多方面進(jìn)行研究，以期建立并優(yōu)化高效、穩(wěn)定的紅富士蘋果離體葉片再生體系，從而為其遺傳改良奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.紅富士蘋果離體葉片不定芽起源及發(fā)育的研究結(jié)果表明：不定芽的發(fā)生過程是，葉片接種4d左右為細(xì)胞啟動分化階段，隨后細(xì)胞加速分裂，培養(yǎng)7～10d時形成分生細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)到14d時形成不定芽原基，14d以后不定芽原基開始向完整的不定芽分化，培養(yǎng)到18～21d時不定芽形成,21d以后不定芽開始伸長生

3、長；研究還發(fā)現(xiàn)紅富士蘋果離體葉片不定芽的起源部位主要是葉片表皮細(xì)胞和葉片維管束周圍的維管束鞘細(xì)胞，屬于多起源；發(fā)生途徑具有多樣性。
　　 2紅富士蘋果離體葉片不定芽再生過程中生理生化變化2.1內(nèi)源激素含量及平衡的變化葉片細(xì)胞啟動分化期需要較高含量的ZR、IAA和ABA，且暗培養(yǎng)下內(nèi)源激素含量高于光培養(yǎng)的，細(xì)胞旺盛分裂期需要高含量的ZR和ABA及低含量的IAA；且暗培養(yǎng)下內(nèi)源激素含量高于光培養(yǎng)的。不同外源細(xì)胞分裂素對內(nèi)源激素變化的

4、影響存在顯著差異，TDZ誘導(dǎo)的葉片內(nèi)源ZR和ABA含量顯著高于BA誘導(dǎo)的，IAA的含量顯著低于BA誘導(dǎo)的。內(nèi)源ZR/IAA與ABA/IAA的比值均呈現(xiàn)先升高再降低、再升高-降低的趨勢，且光下培養(yǎng)的比值低于暗培養(yǎng)的，TDZ誘導(dǎo)的比值高于BA誘導(dǎo)的。GA3的結(jié)果表明，其對葉片不定芽再生有負(fù)作用。綜合分析，不定芽再生需要較高含量的ZR和ABA及一定量的IAA，同時細(xì)胞啟動分化期和芽原基形成階段高比值的ZR/IAA和ABA/IAA有利于不定芽的

5、分化。
　　 2.2內(nèi)源多胺含量及平衡的變化葉片離體培養(yǎng)過程中，內(nèi)源多胺含量峰值均出現(xiàn)在培養(yǎng)前期，Put含量高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)3d時，而Spm和Spd的高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)7d時。光培養(yǎng)下的內(nèi)源多胺含量顯著低于暗培養(yǎng)下的，TDZ誘導(dǎo)的葉片內(nèi)源多胺含量顯著高于BA誘導(dǎo)的。結(jié)果表明，在葉片細(xì)胞啟動分化期及不定芽原基誘導(dǎo)初期需要高含量的內(nèi)源多胺，并且在不定芽分化時期內(nèi)源多胺含量也一直維持在較高水平；同時各內(nèi)源多胺之間的比值也是前期處于較高水平，

6、但是比值之間的差異不明顯?？梢?，不定芽再生需要較高含量的內(nèi)源多胺，且內(nèi)源多胺的平衡對不定芽的誘導(dǎo)有一定的影響。
　　 2.3酶活性的變化葉片離體培養(yǎng)過程中，在葉片培養(yǎng)初期及后期較高的SOD酶活性有利于葉片不定芽的分化及發(fā)育；在后期較高的POD酶活性有利于不定芽發(fā)育；培養(yǎng)前期較低水平的CAT酶活性有利于不定芽的誘導(dǎo)，培養(yǎng)后期較高的CAT酶活性有利于不定芽的形成；IOD酶活性變化比較復(fù)雜，且IOD活性與IAA含量密切相關(guān)。
　

7、　 2.4 NO含量的變化葉片離體培養(yǎng)以后，葉片內(nèi)NO含量明顯提高。首先，葉片細(xì)胞啟動分化期及細(xì)胞旺盛分裂期需要維持較高水平的NO含量，才能誘導(dǎo)不定芽原基的產(chǎn)生；其次，在培養(yǎng)后期也需要較高含量的NO才有利于不定芽的發(fā)育。在不定芽誘導(dǎo)過程中，光下培養(yǎng)的葉片NO含量顯著低于暗培養(yǎng)的；TDZ誘導(dǎo)的葉片NO含量高于BA誘導(dǎo)的。
　　 3紅富士蘋果離體葉片高效再生不定芽體系的優(yōu)化結(jié)果表明：較適宜葉片再生不定芽的生長調(diào)節(jié)劑為TDZ 6.0

8、 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，最適宜的暗培養(yǎng)時間為3周，最適宜的糖為蔗糖，最佳的繼代苗齡為25d左右。在上述培養(yǎng)條件下紅富士蘋果離體葉片再生率達(dá)到100％，平均葉片再生芽數(shù)達(dá)到10.6個。另外，卡那霉素能顯著抑制紅富士蘋果葉片不定芽再生，但因固化劑不同其抑制效果不同，在6.2 g/L瓊脂做固化劑時，10 mg/L卡那霉素可完全抑制葉片再生，而在5.0 g/L Polygel的培養(yǎng)基上，卡那霉素50 mg/L才能完全抑制葉片再生。