亞麻離體再生及早期體細(xì)胞胚胎發(fā)生機(jī)理的研究.pdf

1、亞麻是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，亞麻莖桿可以剝?nèi)「邫n纖維用于紡織業(yè)，籽?？梢哉ブ聘缓卟伙柡椭舅岬臓I(yíng)養(yǎng)保健油品。黑龍江省是我國(guó)纖維亞麻的主要產(chǎn)區(qū)，隨著人們生活水平的提高，發(fā)展亞麻生產(chǎn)顯得越來(lái)越重要。本文選擇特點(diǎn)各異的國(guó)產(chǎn)品種黑亞14和引進(jìn)品種Opaline為代表，對(duì)纖維亞麻在器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的組織細(xì)胞學(xué)、生理生化特性、內(nèi)源激素含量變化、RAPD標(biāo)記進(jìn)行了研究，以闡述其發(fā)生機(jī)理。研究結(jié)果如下： 1.對(duì)亞麻器官發(fā)生途徑的培

2、養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，試驗(yàn)得出了不同基因型無(wú)菌苗的最佳消毒時(shí)間，10-15日齡的無(wú)菌苗活性較好，亞麻下胚軸是誘導(dǎo)愈傷組織最理想的取材部位，平放外植體對(duì)出愈最有利。器官發(fā)生途徑的初始愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為Ms+4mg/LIAA+2mg/LKT：誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的最佳培養(yǎng)基為B5+2.5mg/LKT+1mg/LIAA：出苗后最佳生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2B5+0.3mg/LIBA。初始愈傷組織誘導(dǎo)周期為20d左右，呈淡綠色，質(zhì)地致密堅(jiān)硬。不定芽誘

3、導(dǎo)周期為30d，IAA與KT是誘導(dǎo)亞麻愈傷組織出芽的關(guān)鍵物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中基因型間生長(zhǎng)趨勢(shì)差異明顯，添加1.5g/L的活性炭可降低愈傷組織褐化率。 2.以體胚發(fā)生為目的的亞麻初始愈傷組織的誘導(dǎo)，需要高濃度的2，4-D和較低濃度6-BA，但是過高濃度的2.4-D會(huì)抑制出愈和愈傷組織的生長(zhǎng)，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為Ms+2mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA；體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5mg/LNAA+0.5mg/L6-BA；胚性愈

4、傷組織大多呈黃白色，小顆粒狀、松散易剝離，表面濕潤(rùn)?；蛐蛯?duì)體胚發(fā)生影響明顯，本實(shí)驗(yàn)只在H14體胚誘導(dǎo)中得到了球形胚和心形胚。另外光的變化對(duì)亞麻體胚發(fā)生沒有影響。 3.組織細(xì)胞學(xué)研究表明。亞麻胚性愈傷組織細(xì)胞規(guī)則，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)濃，非胚性愈傷組織細(xì)胞體積大，細(xì)胞核小，細(xì)胞質(zhì)稀薄。體細(xì)胞胚發(fā)生經(jīng)歷了胚性細(xì)胞團(tuán)、2細(xì)胞、3細(xì)胞、多細(xì)胞原胚、球形胚、心形胚發(fā)育階段，但是沒有更遠(yuǎn)的發(fā)展。PAS反應(yīng)中，H14外植體下胚軸的橫切可見到皮層

5、內(nèi)側(cè)有淀粉粒分布，OP外植體子葉的橫切可觀察到柵欄組織細(xì)胞有淀粉粒分布：H14和OP初始愈傷組織外緣淀粉粒較多。H14和OP胚性愈傷組織胚性細(xì)胞含有大量的淀粉粒，與細(xì)胞的進(jìn)一步分裂和分化提供能量有關(guān)。 4.透射電鏡觀察表明，初始愈傷組織細(xì)胞有非常明顯的中央大液泡，細(xì)胞質(zhì)被中央大液泡擠壓成一薄層分布于細(xì)胞的邊緣，細(xì)胞核被大液泡擠壓，位于細(xì)胞的一角，但仍可觀察到核仁的存在。胚性愈傷組織細(xì)胞壁與初始愈傷組織細(xì)胞壁相比加厚，細(xì)胞質(zhì)濃厚，

6、充滿整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞核大，核仁明顯，在靠近細(xì)胞膜的胞質(zhì)區(qū)域里有較多的淀粉粒，還可觀察到其內(nèi)含有淀粉粒的葉綠體。非胚性愈傷組織細(xì)胞幾乎完全為中央大液泡所占據(jù)，細(xì)胞質(zhì)被擠壓在四周，很難觀察到細(xì)胞核和其它細(xì)胞器。褐化組織細(xì)胞器崩解基本沒有細(xì)胞器。掃描電鏡觀察表明，亞麻初始愈傷組織表面較質(zhì)密，細(xì)胞之間排列緊密，沒有空隙；胚性愈傷組織表面較光滑，細(xì)胞形成團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，形成團(tuán)粒的細(xì)胞之間結(jié)合緊密，團(tuán)粒與團(tuán)粒之間結(jié)合松散，可觀察到大的空隙，細(xì)胞形狀較規(guī)則。

7、非胚性和褐化愈傷組織表面形狀不規(guī)則，有較多的覆蓋物，呈片狀，細(xì)胞形狀不規(guī)則，體積較大。 5.在胚性愈傷中的CAT、POD、可溶性蛋白、核酸和可溶性糖含量均高于非胚性愈傷組織，這些物質(zhì)含量和組分的變化可能與胚性的維持和細(xì)胞的旺盛分裂分化有關(guān)。CAT、可溶性糖在無(wú)菌苗含量最高，CAT、核酸、可溶性蛋白、可溶性糖在褐化組織中最低，可以說明褐化愈傷組織的生理狀態(tài)。POD在初始愈傷中含量最高，這與機(jī)械性損傷有關(guān)；SOD在無(wú)菌苗和不定芽期含

8、量高.初始愈傷組織中的含量是最低的。與其抗氧化能力密切相關(guān)；可溶性糖等指標(biāo)在原胚和球形胚時(shí)期均呈上升趨勢(shì)。為體胚發(fā)生作好物質(zhì)和能量上的準(zhǔn)備。 6.SDS-PAGE結(jié)果顯示，非胚性愈傷組織蛋白染色非常淺，蛋白代謝非常弱。亞麻體胚發(fā)生各時(shí)期的主要蛋白質(zhì)組分相似，體現(xiàn)了體胚蛋白質(zhì)組分的穩(wěn)定性。H14各個(gè)階段的蛋白質(zhì)范圍約為24-94kD，OP各個(gè)階段的蛋白質(zhì)范圍約為20-100kD。在亞麻體細(xì)胞胚胎發(fā)生早期，共出現(xiàn)了9條POD同工酶酶

9、帶，其中有6條帶是在亞麻體胚發(fā)生早期各階段陸續(xù)出現(xiàn)的，可以作為體細(xì)胞胚發(fā)生的生化標(biāo)記。淀粉同工酶在亞麻體胚發(fā)生早期出現(xiàn)的條帶很少，酶帶在非胚性和褐化組織中較多，而且淀粉同工酶的條帶數(shù)也因品種不同而不同。亞麻早期體胚發(fā)生過程中。各個(gè)階段EST同工酶酶帶顏色由深到淺，這與POD同工酶酶帶顏色和淀粉同工酶酶帶顏色的變化相反。 7.內(nèi)源激素水平和激素間的平衡對(duì)亞麻形態(tài)建成具有重要的調(diào)節(jié)作用。胚性愈傷組織中的IAA含量高于非胚性愈傷組織，

10、而且在原胚期和球形胚時(shí)期都保持了較高的水平，褐化組織中的IAA含量最低。ABA在外植體中的含量最高，在原胚和球形胚時(shí)期較低，低含量水平的ABA有利于胚的形成。ZR的峰值出現(xiàn)在初始愈傷中，胚性愈傷中的ZR含量低于非胚性愈傷。胚性愈傷中的IAA/ZR遠(yuǎn)高于非胚性愈傷，這可能有利于胚性能力的表達(dá)。 8.本實(shí)驗(yàn)中，亞麻染色體數(shù)2n=32，繼代5次以后變異率為2.5％，繼代9次后變異率為4.3％，既有數(shù)量變異，也觀察到有染色體結(jié)構(gòu)的變異。