大豆NAC轉(zhuǎn)錄因子和RBR泛素連接酶編碼基因的鑒定與功能分析.pdf

1、大豆(Glycinemax(L.)Merrill)是屬于豆科、蝶形花亞科、大豆屬的二倍體(2n=40)植物，是人類植物性蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一，又是重要的飼料和工業(yè)原料。借助分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法研究大豆的功能基因?qū)⒂欣谔岣叽蠖巩a(chǎn)量、品質(zhì)以及抗性?；虻霓D(zhuǎn)錄表達(dá)在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境等生命活動(dòng)中起著極其重要的作用，植物體基因組中編碼了大量轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，例如，植物基因組中的AP2/ERF,WRKY,ARF和NAC（NAM，

2、ATAF1，CUC2）等轉(zhuǎn)錄因子家族。然而僅對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行調(diào)控，仍然不能實(shí)現(xiàn)對(duì)相應(yīng)生命過(guò)程的精確控制，還需要對(duì)包括基因的轉(zhuǎn)錄在內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑中的不同階段在時(shí)間和空間上進(jìn)行準(zhǔn)確地調(diào)控，例如蛋白翻譯、蛋白修飾等。其中蛋白泛素化修飾是真核生物中特有且重要的蛋白翻譯后修飾過(guò)程，廣泛地參與了對(duì)有機(jī)體生理活動(dòng)的調(diào)控。
　　本文擬通過(guò)鑒定、克隆和分析大豆中的NAC轉(zhuǎn)錄因子和RBR(RING-IBR-RING)泛素連接酶基因以及其功能

3、，為大豆基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白泛素化修飾的研究提供基礎(chǔ)。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化、蛋白序列及結(jié)構(gòu)分析的方法對(duì)包含三種豆科植物在內(nèi)的NAC和RBR家族蛋白進(jìn)行分析，研究豆科植物（特別是大豆）中NAC轉(zhuǎn)錄因子家族和RBR家族的進(jìn)化特點(diǎn)。并利用組織表達(dá)、啟動(dòng)子分析、原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)、酵母單雜交、以及異源表達(dá)等方法對(duì)鑒定到的5個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子和11個(gè)RBR基因做了初步的分析，為進(jìn)一步研究?jī)蓚€(gè)家族基因在細(xì)胞信號(hào)傳遞過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。
　　一、NAC轉(zhuǎn)錄

4、因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)、細(xì)胞凋亡、組織衰老和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生理活動(dòng)。本中心（國(guó)家大豆改良中心）研究人員從栽培大豆94-16的子葉折疊突變體中克隆的一個(gè)在根和葉片中上調(diào)表達(dá)的NAC基因，序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的GmNAC28(EU661925)相同，但該基因的功能并不清楚。本文從大豆94-16中克隆到4個(gè)新的編碼NAC家族蛋白的基因，分別命名為GmNLP1（GlycinemaxNAM

5、-likeProtein1）-GmNLP4，并對(duì)包括GmNAC28在內(nèi)的這5個(gè)基因進(jìn)行了組織表達(dá)分析、啟動(dòng)子分析以及轉(zhuǎn)基因等研究。
　　1.通過(guò)對(duì)Phytozome等數(shù)據(jù)庫(kù)中NAC家族蛋白序列搜索與分析，發(fā)現(xiàn)編碼NAC家族蛋白的基因存在于除兩種藻類以外的其它植物中，獲得包括大豆在內(nèi)的三十種植物的2676條NAC家族蛋白序列。對(duì)不同物種基因組中編碼NAC家族蛋白的基因的分析表明，被子植物中由于基因重復(fù)造成NAC家族基因數(shù)量增加。對(duì)豆

6、科（大豆、蒺藜苜蓿和菜豆），十字花科（擬南芥和油菜）和禾本科（水稻、玉米和谷子）的1109條NAC家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，NAC家族蛋白可以劃分為八個(gè)不同的亞家族(Ⅰ～Ⅷ)。其中編碼亞家族Ⅷ的基因在豆科植物缺失。對(duì)NAC家族蛋白的序列結(jié)構(gòu)分析表明各亞家族NAC結(jié)構(gòu)域之間存在明顯的差異，而在族內(nèi)則表現(xiàn)保守。GmNLP1-GmNLP4和GmNAC28與CUC2，NACl等蛋白被聚在家族Ⅰ，并具有保守的DNA結(jié)合和二聚體形成必須的氨基酸殘

7、基。擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子家族Ⅰ的基因參與頂端生長(zhǎng)組織形成、子葉分離、葉片形態(tài)形成、植株衰老、以及側(cè)根形成等生理過(guò)程，因此推測(cè)在大豆中家族Ⅰ的基因GmNLP1-GmNLP4及GmNAC28可能具有類似的功能。對(duì)五個(gè)基因編碼的蛋白序列的分析表明，GmNLP1和GmNLP2蛋白之間的相似性為92.0％，GmNLP3和GmNAC28蛋白之間的相似性為76.6％。而其它三個(gè)基因之間以及與GmNLP1或GmNLP2的蛋白序列之間的相似性均不超過(guò)60

8、％。
　　2.GmNLP1-GmNLP4和GmNAC28基因在大豆根、莖、葉、花以及種子中的組織表達(dá)分析表明:GmNLP1和GmNLP2基因在大豆的根、花和種子等組織中表達(dá)，但GmNLP2基因在根部的表達(dá)水平較GmNLP1基因高而在花中則較低;GmNLP3基因在根、莖、花和種子表達(dá)，其中在根中具較高的表達(dá)水平;GmNLP4基因特異性地在根和花中表達(dá)，且表達(dá)水平比較低;GmNAC28基因在所有研究的組織中均有表達(dá)，但在根和種子中的表

9、達(dá)水平比較高。對(duì)種子發(fā)育過(guò)程中5個(gè)基因的表達(dá)分析表明GmNLP1-GmNLP3和GmNAC28基因的表達(dá)持續(xù)了種子發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，但未檢測(cè)到GmNLP4基因在種子中的表達(dá)。GmNLP1和GmNLP2基因的表達(dá)水平隨種子發(fā)育提高，但在不同的時(shí)期出現(xiàn)了峰值。GmNLP3基因在種子發(fā)育過(guò)程中持續(xù)較高的表達(dá)水平。
　　3.擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果證明5個(gè)NAC編碼的蛋白均定位于細(xì)胞核中;酵母轉(zhuǎn)錄激活活性試驗(yàn)表明5個(gè)基因都具有轉(zhuǎn)錄激活活性

10、，證明5個(gè)基因是作為轉(zhuǎn)錄激活因子參與細(xì)胞核中基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。同源基因或者具有相似結(jié)構(gòu)的基因往往具有相似的功能。本研究通過(guò)異源表達(dá)方法對(duì)克隆的大豆NAC基因在形態(tài)發(fā)生（植物器官形態(tài)建立）等生理過(guò)程中功能進(jìn)行研究。轉(zhuǎn)化擬南芥及其NAC家族基因功能缺失突變體的結(jié)果表明，未觀察到過(guò)量表達(dá)5個(gè)NAC基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)葉片、花以及莢果等器官明顯的形態(tài)變化。過(guò)量表達(dá)GmNLP3和GmNAC28基因的轉(zhuǎn)基因植株未出現(xiàn)提前衰老的現(xiàn)

11、象。在突變體(cuc1-13，cuc2-3)中過(guò)量表達(dá)GmNLP4基因未能夠回復(fù)其野生型表型。原因可能為:(1)NAC家族基因的功能冗余，過(guò)量表達(dá)未必能夠引起明顯的形態(tài)變化;(2)轉(zhuǎn)化的大豆基因與擬南芥突變體基因的功能不同而不能實(shí)現(xiàn)功能互補(bǔ)等。因此進(jìn)一步將大豆內(nèi)的這些基因沉默也許能夠有助于揭示其在大豆中的功能。
　　4.進(jìn)一步分析GmNAC28基因的啟動(dòng)子序列，并通過(guò)構(gòu)建具不同長(zhǎng)度缺失的啟動(dòng)子植物表達(dá)載體(ProGmNAC28∶G

12、US)對(duì)該基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。ProGmNAC28∶GUS研究結(jié)果表明GmNAC28基因的表達(dá)位于葉緣齒尖、柱頭、花瓣與花萼的離層組織、衰老的花絲和雄蕊、以及根冠和根部維管組織中。啟動(dòng)子分析與GmNAC28組織表達(dá)分析結(jié)果一致，并進(jìn)一步表明GmNAC28基因可能與大豆組織的衰老相關(guān)，在根中作用于根部維管組織。在GmNAC28基因的啟動(dòng)子序列中鑒定到兩段功能序列，分別包含一段參與GmNAC28基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的順式作用元件，其中的一段

13、序列位于基因上游-1015-1378bp之間，該序列的存在降低GmNAC28基因的表達(dá)水平;另一段序列位于+1-253bp之間，該序列是GmNAC28基因表達(dá)必須的，缺失導(dǎo)致GmNAC28基因不能夠表達(dá)。
　　二、蛋白泛素化修飾是細(xì)胞生命過(guò)程中重要的生化過(guò)程，在細(xì)胞中執(zhí)行多種重要的功能，例如，蛋白質(zhì)降解、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)傳遞、細(xì)胞分化與凋亡。RBR是新發(fā)現(xiàn)的含RING結(jié)構(gòu)的一類蛋白，其中很多RBR具有泛素連接酶功能。動(dòng)物中的

14、研究表明該家族的成員參與了多種重要的生理活動(dòng)，但對(duì)該家族在植物中具體的功能還很少報(bào)道。
　　1.在大豆基因組中鑒定到24個(gè)編碼RBR結(jié)構(gòu)域蛋白的基因，其中八個(gè)基因編碼的蛋白序列存在大片段缺失。對(duì)包含大豆等共32種植物中的651條含RBR結(jié)構(gòu)域的蛋白序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，將這些RBR家族蛋白劃分為六個(gè)亞家族（ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅠ/Helicase，PlantⅡA/B，PlantⅡC和ARA54）。大豆中

15、RBR家族同樣可以劃分到上述六個(gè)亞家族中。通過(guò)分析RBR結(jié)構(gòu)域之外的蛋白序列結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)進(jìn)一步證明了上述進(jìn)化分析結(jié)果，ARIADNEA與ARIADNEB、PlantⅡA/B與PlantⅡC亞家族之間在蛋白結(jié)構(gòu)上都表現(xiàn)出了較大的差異。對(duì)不同物種中RBR家族的分析表明，六個(gè)亞家族中除PlantⅡC和Helicase亞家族僅在被子植物中發(fā)現(xiàn)外，其余亞家族也存在于藻類和苔蘚類等低等植物中，說(shuō)明RBR家族出現(xiàn)于藻類與其它種類的植物分離之前。本文

16、從大豆品種NN1138-2中克隆了11個(gè)包含有完整RBR結(jié)構(gòu)域的大豆基因，并對(duì)它們進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)以及功能定位等分析。
　　2.克隆的11個(gè)RBR基因分別屬于ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅠ/Helicase，PlantⅡA/B，PlantⅡC等五個(gè)亞家族。對(duì)各個(gè)亞家族的蛋白序列分析表明，每個(gè)亞家族蛋白除具有保守的RBR結(jié)構(gòu)域外，不同亞家族的蛋白序列中還含有獨(dú)特的蛋白結(jié)構(gòu)域。基因重復(fù)使大豆基因組中具有九個(gè)P

17、lantⅡC亞家族基因，但序列和表達(dá)分析表明只有兩個(gè)基因是能夠表達(dá)的功能基因。原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示克隆的大豆ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅡA/B，PlantⅡC等亞家族基因定位于細(xì)胞核中，推測(cè)這些家族基因可能參與細(xì)胞核內(nèi)蛋白的泛素化修飾。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)在Heliease和PlantⅡA/B亞家族成員蛋白序列中含有能夠與DNA和RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明Helicase和PlantⅡA/B亞家族蛋白在執(zhí)行細(xì)胞功能的過(guò)

18、程中需要核酸的參與。通過(guò)組織表達(dá)分析對(duì)ARIADNEA，ARIADNEB，PlantⅡA/B，PlantⅡC等亞家族的11個(gè)基因研究表明，這些亞家族的RBR基因在大豆根、莖、葉、花以及發(fā)育中的種子等多個(gè)組織中均有表達(dá)。其中PlantⅡC亞家族基因GmRTRP5表現(xiàn)出與其他10個(gè)基因不同的特點(diǎn)，在各種組織的表達(dá)水平很低。qRT-PCR表明GmRTRP3-GmRTRP5等基因參與了植物對(duì)激素ABA、GA3以及Na+脅迫的響應(yīng)途徑。
　

19、　基因轉(zhuǎn)錄和蛋白泛素化修飾是調(diào)控植物細(xì)胞生理活動(dòng)的兩種重要途徑。大量研究表明通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白泛素化修飾來(lái)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄是表達(dá)調(diào)控的一個(gè)重要途徑，且已有實(shí)驗(yàn)證明NAC家族轉(zhuǎn)錄因子中一些成員受到了泛素化修飾的調(diào)控，如SINAT5促進(jìn)NACl蛋白泛素化修飾來(lái)抑制生長(zhǎng)素信號(hào)傳遞。進(jìn)一步研究RBR家族基因的功能，以及RBR泛素連接酶是否與NAC轉(zhuǎn)錄因子之間存在調(diào)控關(guān)系，將有利于我們進(jìn)一步了解蛋白泛素化修飾和NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑