1型鴨肝炎病毒VP0基因表達及重組蛋白ELISA方法的建立.pdf

1、分 類 號華 中農(nóng)業(yè) 大 學碩 士 學位 論 文1 型 鴨肝 炎病 毒 VP O 基 因表 達 及重組 蛋 白 E L !S A 方法 的建 立E x P r e ssio no fth eV P OG e n eo fD u c kH e P a titisVi r u sT y Pe1an dD ev el0P m en tofE L ISAB asedonR e C 0 m b in a lltP r o te ill研 究 生

2、: 陳 敏指 導 教 師 : 程 國富 教 授指 導 小 組 : 程 國富 教 授胡 薛英 副 教授張 萬 坡 副教 授谷 長 勤 講 師專 業(yè) : 基 礎 獸 醫(yī)學獲得 學位 名 稱 : 農(nóng) 學 碩 士研 究方 向: 獸 醫(yī)病 理 學獲得 學位 時 間 : 2010 年 6 月華 中農(nóng)業(yè) 大學動物 醫(yī)學 院二 0 一 0 年 六 月華 中農(nóng)業(yè) 大 學 20 10 屆碩 士 畢業(yè) 論文2. 2 重 組 表 達質(zhì) 粒 的構(gòu) 建 . . .

3、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …… 162. 2.1 帶 有 粘 性 末 端 VP O 基 因片 段 和 載 體 pG E X 一 K G 的制 備 . . . . . . .

4、 . . . …… 162. 2. 2V P O 基 因與 載 體 pG E X 一 K G 的連 接 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …… 17混 勻 后 ， 16 oC連 接 過 夜 。 . . . . . . ……， . . …， . . ……， ， 二 ， …， 二 ， . . ……，

5、. . . . . ……， . …， …， . . … 172. 2. 3 重 組 陽性 表 達 質(zhì) 粒 的篩 選 與 鑒 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……172 . 2 . 4 重 組 質(zhì) 粒 pG E X 一 K G 一 V P o 的 P c R 鑒 定 . . …， .

6、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …… 172 . 2 . 5 重 組 質(zhì) 粒 pG E X 一 K G 一 VP o 的 酶 切 鑒 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …… 182. 2. 6 重 組 質(zhì) 粒 的序 列 測 定 .

7、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …… 182 . 3 重 組 表 達 質(zhì) 粒 在 E . coliB L 21 (D E 3)菌 中 的誘 導表 達 及 檢 測 . . . . . . . . . . . .

8、. . ……182 . 3.1SD S一 PA G E 電泳 ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …… 192 . 3. 2 重 組 蛋 白 的可 溶 性 分 析 . .

9、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……， . ， . . . . . . . . . . . . …… 192 . 3. 3 包 涵 體 形 式 蛋 白的純 化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

10、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …… 192 . 3. 4 可 溶 性 蛋 白的 純 化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……202

11、. 3. 5 純 化 的可 溶 性 V P O 和 包 涵 體 V P O 濃 度 的測 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……202. 4 可 溶 性 VP O 以及 包 涵 體 VP O 間接 E LI SA 方法 的建 立 . . . . ……， . . . . . . . . . . ……202. 4.1 重 組 蛋 白 V P O 間接 E LI SA 操 作

12、程 序 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……202. 4.2V PO 間接 E LI SA 最 佳 包 被濃 度 和 最 佳 血 清 工 作 濃 度 的確 定 . . ……202. 4. 3 最 佳 包 被 條 件 的確 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

13、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……212 . 4.4 最 佳 封 閉 時 間 的確 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

14、. . . . . . . . . . . . . . . . ……212 . 4 . 5 最 佳 血 清 工 作 時 間 的確 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……212 . 4 . 6 最 佳 酶 標 二 抗 工 作 濃 度 的確

15、定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……212 . 4 . 7 最 佳 酶 標 二 抗 反應 時 間 的確 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

16、. . . . . . . . . . ……222. 4 . 8 最 佳 顯 色 時 間 的確 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……222 . 4. 9 陰 陽性 臨 界值 的確 定 . . . . .

17、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……222 . 4 .10 特 異 性 試 驗 . . . . . . . . . . . . ……， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

18、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……222 . 4 .n 標 準 曲線 的建 立 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

19、 . . . . . . . . . . . . . ……232 . 4 .12 重 復 性 試 驗 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……232.

20、4 .13 包 被 抗 原 保 存 期 的確 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……232. 4.14 盲 樣 檢 測 . . ……， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

21、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……， . . . . . . . . . . . . . . ……232. 4 .15 平 行 對 比試 驗 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

22、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……232. 5 間接 E LI SA 方 法 檢 測 血 清 抗 體 的應 用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……242. 5.1 雛 鴨母 源 抗 體 消 長 規(guī) 律 的變 化

23、 . …， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……242. 5. 2 血 清 學 調(diào) 查 樣 品 的檢 測 . . . . . . . . . ……， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

24、 . . . . . . . . . . . ……243 結(jié) 果 與 分 析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

25、 . . . . . . ……243 .1 1 型 鴨 肝 炎 弱 毒 病 毒 的濃 度 鑒 定 . . . . . . . ……， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……243 . 2D H V- 1 間接 E LI SA 方 法 的建 立 . …， . ……， . . . . . . . .

26、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……243. 3 重 組 表 達 質(zhì) 粒 的 P C R 鑒 定 和 酶 切 鑒 定 . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……243

27、 . 4 序 列 測 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……253 . 5V P O 的表 達 及 S

28、D S一 PA G E 分 析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……253. 6V P O 蛋 白的可 溶 性 分 析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……， . . .

29、. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……263. 7 包 涵 體 蛋 白和 可 溶 性 蛋 白的純 化 與 濃 度 的測 定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ……273. 8 可 溶 性 V P O 以及 包 涵 體