鸚鵡幼雛病病毒全序列分析及VP1基因克隆與表達(dá).pdf

1、該研究針對(duì)湖北分離株BFDV-HBYM02毒株,采用分子生物學(xué)方法,進(jìn)行全基因組序列測(cè)定與分析,以及相關(guān)重要功能基因的研究,為BFD的有效防治和檢測(cè)手段的研究打下基礎(chǔ).該文主要完成了以下研究工作:(1)完成了BFDV-HBYM02毒株全序列測(cè)定:a.通過(guò)BLAST分析同源性,HBYM02株與GENBANK中僅有的6株BFDV全序列同源性為98﹪-99﹪,表明HBYM02株與這六株BFDV毒株為同一個(gè)基因型.分析不同基因組區(qū)域內(nèi)堿基的變異

2、,可知T抗原變異率最高,有18個(gè)堿基位點(diǎn)發(fā)生改變,未知蛋白沒(méi)有堿基的改變,最為保守,推測(cè)T抗原高突變可能與BFDV廣泛宿主范圍有關(guān),以適應(yīng)其在不同鳥(niǎo)類(lèi)中傳播,未知蛋白高度保守對(duì)于BFDV晚期蛋白的表達(dá)調(diào)控起重要作用.b.采用Phylip3.5軟件作出進(jìn)化樹(shù),結(jié)果表明,來(lái)源于不同宿主的BFDV具有單獨(dú)的進(jìn)化規(guī)律,與宿主關(guān)系緊密,但是與地理分布沒(méi)有明顯的相關(guān)性.(2)HBYM02-VP1基因克隆:VP1基因是BFDV主要結(jié)構(gòu)蛋白.根據(jù)HBY

3、M02株全基因組序列設(shè)計(jì)VP1基因引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增VP1片段,采用pMD18T載體系統(tǒng),構(gòu)建HBYM02-VP1質(zhì)粒.經(jīng)BLAST分析,HBYM02-VP1與GENBANK內(nèi)BFDV的VP1基因同源性為96﹪-99﹪,顯示VP1是一個(gè)相對(duì)保守的基因片段.(3)HBYM02-VP1基因的表達(dá):利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組蛋白分子量58KD,融合蛋白占菌體總蛋白的24﹪;經(jīng)可溶性分析,確認(rèn)表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在;重組蛋白經(jīng)親和柱

4、層析純化后純度為90﹪.利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)初步完成VP1基因的真核表達(dá),重組蛋白分子量為42KD.經(jīng)Western-blotting證明兩個(gè)系統(tǒng)表達(dá)的VP1蛋白都具有免疫學(xué)活性.綜上述,該文針對(duì)HBYM02株進(jìn)行全基因組序列測(cè)定與分析,探討其與己知BFDV分離株的同源性與進(jìn)化關(guān)系,表明目前世界范圍內(nèi)的IBDV僅一種基因型,為BFDV的分子流行病學(xué)研究提供了分子基礎(chǔ),為各類(lèi)有效控制BFD的各類(lèi)疫苗的研制打下了基礎(chǔ).針對(duì)BFDV主要結(jié)構(gòu)蛋