大白菜幾丁質(zhì)酶基因CHB4的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、幾丁質(zhì)酶是一種能催化真菌細(xì)胞壁的重要成分—幾丁質(zhì)降解的糖苷酶，普遍存在于大白菜、煙草等高等植物中，因在抑制真菌的生長(zhǎng)增殖、提高植物的抗病性等方面具有重要作用，現(xiàn)已成為當(dāng)前科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。本文通過(guò)PCR反應(yīng)及RACE技術(shù)，從大白菜基因組DNA及RNA中分別擴(kuò)增出大白菜幾丁質(zhì)酶全基因及成熟肽基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-CHB4，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)并對(duì)該基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析、生物活性和功能

2、分析。結(jié)果表明： 1.根據(jù)已知十字花科植物幾丁質(zhì)酶基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，以大白菜葉片基因組DNA為模板，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為1Kb的特異性DNA片段和幾丁質(zhì)酶N端序列片段(150bp)。選取經(jīng)1mmol.L-1水楊酸處理后的大白菜植株葉片提取RNA，利用RACE技術(shù)擴(kuò)增該基因的3'端436bp。 2.以大白菜葉片基因組DNA為模板，利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1517bp的幾丁質(zhì)酶全基因；以水楊酸誘導(dǎo)的大白

3、菜葉片RNA為模板，通過(guò)RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增出長(zhǎng)度為811bp幾丁質(zhì)酶成熟肽基因。 3.生物信息學(xué)分析表明，該幾丁質(zhì)酶基因全長(zhǎng)1517bp，其中內(nèi)含子序列長(zhǎng)度為508bp(DDBJ登錄號(hào)為AB257452)，編碼由268個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(pI/Mw：8.28/28701.23，www.expasy.org)。與其他物種ClassⅣ類(lèi)幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的多重比較表明(DNAMAN)，與油菜ClassⅣ類(lèi)幾丁質(zhì)酶的同源性達(dá)9

4、9％，與其他已知高等植物ClassⅣ類(lèi)幾丁質(zhì)酶的同源性達(dá)50％以上。說(shuō)明所克隆的大白菜幾丁質(zhì)酶基因是編碼ClassⅣ類(lèi)幾丁質(zhì)酶的基因。 4.構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-CHB4，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明，該基因表達(dá)的蛋白分子量為28kD左右，其表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。 5.通過(guò)改變誘導(dǎo)表達(dá)的參數(shù)發(fā)現(xiàn)，25℃的低溫并不能改變表達(dá)蛋白的可溶性，而在pH9.5的培養(yǎng)基條件下，表達(dá)產(chǎn)物的上清液中卻有重

5、組蛋白條帶出現(xiàn)，表明堿性環(huán)境有利于蛋白質(zhì)的折疊和二硫鍵的交換。 6.以酵母菌為指示菌做抑菌圈試驗(yàn)，結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白液處理后，抑菌圈大小變化明顯，當(dāng)IPTG濃度為0.6mmol/L時(shí)抑菌效果最佳。 7.通過(guò)對(duì)不同IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定，結(jié)果表明，當(dāng)IPTG濃度為0.6mmol/L時(shí)，幾丁質(zhì)酶活力達(dá)到最大值2.8U，明顯高于原菌液幾丁質(zhì)酶活力1.2U。 綜上所述，本文成功地從