新城疫分離株P(guān)和HN基因分子進(jìn)化與致病性的相關(guān)研究.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種烈性傳染病，發(fā)病急，感染率和死亡率高，有時(shí)高達(dá)100％，它主要危害禽類(lèi)，特別是雞。該病在全世界廣泛分布，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成重創(chuàng)。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將該病列為必上報(bào)疾病，我國(guó)將該病列為一類(lèi)動(dòng)物疾病。目前，ND流行又呈現(xiàn)新的特點(diǎn)，為ND防治提出了新的挑戰(zhàn)，全面了解 ND的發(fā)病機(jī)制是當(dāng)前急待解決問(wèn)題。
　　NDV是

2、副粘病毒科(Paramyxoviridae)禽副粘病毒屬(Avulavirus)中禽副粘病毒血清Ⅰ型(Avian paramyxoviruses serotype1，APMV-1)唯一成員。它為單股、不分節(jié)的負(fù)鏈 RNA病毒，基因組由15。2kb左右，以3’-NP-P-M-F-HN-L-5’順序排列，至少編碼七種蛋白。其中P基因是唯一能夠編碼多蛋白的基因，其獨(dú)特的基因結(jié)構(gòu)和編碼方式是NDV重新分屬的依據(jù)之一。以往 NDV致病性蛋白研究主

3、要集中病毒囊膜表面的糖蛋白，特別是F蛋白，但是最近科學(xué)家們陸續(xù)發(fā)現(xiàn) NDV的多個(gè)基因產(chǎn)物也參與其中，其中包括源于P基因“RNA編輯”的產(chǎn)物——V蛋白。這些為日益復(fù)雜的新城疫防治提供了新的思路。本研究從1997~2007年感染 ND病料中分離，純化得到14株 NDV野毒株。同時(shí)在近幾十年來(lái)大量 NDV毒株分子流行病學(xué)和生物學(xué)資料基礎(chǔ)上，借助生物信息學(xué)等方法對(duì)所選毒株的血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)基因和/或磷蛋白(P)基因進(jìn)行研究。首次探討了

4、P和HN基因分子進(jìn)化及其相互關(guān)系以及它們與致病性關(guān)系，獲得了如下進(jìn)展:
　　一、ND毒株的分離、鑒定和純化與生物學(xué)特性
　　從我國(guó)不同地區(qū)的雞和鴨等家禽分離14個(gè)毒株，用已知對(duì)NDV、禽流感(H5和H9型)等單因子陽(yáng)性血清作血凝抑制試驗(yàn)(HI)證明均為NDV。同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)上完成了蝕斑純化。經(jīng) MDT(雞胚平均死亡時(shí)間)、ICPI(1日齡雞腦內(nèi)接種致病指數(shù))及IVPI(6周齡雞靜脈致病指數(shù))測(cè)定試驗(yàn)，所有NDV野毒株均為強(qiáng)毒

5、。
　　二、NDV分離株 P基因的分子進(jìn)化與致病性關(guān)系
　　為研究NDV P基因及其編碼蛋白的遺傳特性和NDV流行特點(diǎn)以及致病的作用，將分離到毒株的P基因進(jìn)行克隆、測(cè)序，并從GenBank中選取41個(gè)國(guó)內(nèi)外不同時(shí)期和區(qū)域的NDV毒株P(guān)基因序列，首次進(jìn)行P蛋白和V蛋白系統(tǒng)發(fā)育與致病性關(guān)系研究。氨基酸同源性比較顯示:我國(guó)NDV毒株與疫苗株及國(guó)外毒株比較，P蛋白和V蛋白的同源性低。氨基酸序列分析表明:不同地域分離株P(guān)蛋白序列含有獨(dú)

6、特的氨基酸位點(diǎn)；V蛋白羧基端結(jié)構(gòu)域與NDV侵蝕宿主種屬范圍和毒力強(qiáng)弱有關(guān)。依據(jù)P基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將歷史上NDV分離株分成兩個(gè)分支，一支以20世紀(jì)70年代前北美分離株以及澳大利亞分離株為主，包括Ⅰ~Ⅳ基因型，多以中毒力毒株和弱毒株；另一支由目前世界范圍內(nèi)流行的強(qiáng)毒株構(gòu)成，包括Ⅴ~Ⅶ基因型。
　　三、NDV分離株 HN基因的分子進(jìn)化與致病性關(guān)系
　　將得到的14株 NDV毒株的HN基因進(jìn)行克隆、測(cè)序，與 GenBank中篩選的29

7、個(gè)國(guó)內(nèi)外不同時(shí)期和區(qū)域 NDV毒株的HN基因序列進(jìn)行HN蛋白系統(tǒng)發(fā)育與致病性關(guān)系研究。糖基化位點(diǎn)和抗原指數(shù)分析表明，與國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)強(qiáng)毒株相比，國(guó)內(nèi)流行株有一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)缺失和兩處抗原表位發(fā)生變化。氨基酸序列分析表明:NDV不同基因型毒株的HN蛋白序列含有獨(dú)特的氨基酸位點(diǎn)。HN基因系統(tǒng)發(fā)育和氨基酸同源比較表明:NDV分離株可分成兩大類(lèi)，第一大類(lèi)為最近分離的水禽弱毒株；第二大類(lèi)又可細(xì)分成兩大分支，一支以20世紀(jì)70年代前北美分離株以及澳大利

8、亞分離株為主，包括Ⅰ~Ⅳ基因型；另一支由目前世界范圍內(nèi)流行的強(qiáng)毒株構(gòu)成，包括Ⅴ~Ⅶ基因型。
　　四、NDV分離株 HN和P基因分子進(jìn)化及其相關(guān)比較
　　將分離到的NDV毒株，分別進(jìn)行HN和P基因克隆測(cè)序，結(jié)合15個(gè)已發(fā)表的國(guó)內(nèi)外不同時(shí)期和地域的NDV分離株的HN和P基因，計(jì)算毒株間HN和P基因的不同核苷酸和氨基酸片段進(jìn)化距離，利用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行了片段間進(jìn)化距離的方差分析，HN或P基因核苷酸進(jìn)化距離與毒株分離時(shí)間、HN或P基因片

9、段與其全長(zhǎng)間以及HN和P基因全長(zhǎng)間的相關(guān)分析。統(tǒng)計(jì)分析顯示:NDV HN基因不同核苷酸或氨基酸序列片段變異程度不一樣，P基因同樣如此；不同毒株間的HN基因片段與其全長(zhǎng)間無(wú)論是核苷酸還是氨基酸遺傳變異高度相關(guān)，P基因片段以及HN和P基因全長(zhǎng)間同樣如此。以上說(shuō)明，NDV HN和P基因雖以不同的方式進(jìn)化，但是HN和P基因遺傳變異的趨勢(shì)是相同的。另外，不同毒株與Hert33在分離年代和核苷酸進(jìn)化距離相關(guān)性比較說(shuō)明，HN和P基因的變異與分離時(shí)間有

10、一定的聯(lián)系。
　　五、NDV P蛋白和V蛋白基因分子進(jìn)化分析
　　選取55株 NDV毒株代表不同地區(qū)和時(shí)間 P基因序列，計(jì)算了不同 P蛋白和V蛋白氨基酸片段同源性以及核苷酸同義替代率和非同義替代率，以評(píng)價(jià)不同選擇壓力對(duì)NDV P蛋白和V蛋白基因的影響。結(jié)果顯示:相同核苷酸經(jīng)不同重疊閱讀框編碼得到的氨基酸差異顯著，它們的核苷酸替代方式不同。這說(shuō)明，P基因的重疊閱讀框進(jìn)化是NDV適應(yīng)不同選擇壓力的結(jié)果，也是存在于NDV準(zhǔn)種中的P