異源強(qiáng)毒株HN基因替換對(duì)嵌合體新城疫rLaSota病毒致病力影響的研究.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重大烈性傳染病。由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起，NDV為單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽副黏病毒屬(Avulavirus)。NDV基因組全長15kb，其基因組編碼的蛋白包括核蛋白(nucleoprotein.NP)，磷蛋白(phosphoprotein，P)，基質(zhì)蛋白(matrix pr

2、otein，M)，融合蛋白(fusion proteins，F(xiàn))，血凝素一神經(jīng)氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase，HN)和大聚合酶蛋白(RNA-dependentRNA polymerase or 1arge polymerase，L)六個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄編碼單元。 人們對(duì)新城疫病毒致病性的研究主要集中在F蛋白和HN蛋白的致病力上，認(rèn)為F蛋白的裂解位點(diǎn)的氨基酸序列是新城疫病毒致病性的主要決定因素。NDV的

3、HN蛋白是一個(gè)多功能蛋白，NDV的HN基因在病毒的感染過程中扮演著重要角色，但是HN基因?qū)χ虏⌒缘拇_切作用還不十分明確。HN蛋白具有血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)兩種活性。識(shí)別細(xì)胞表面的唾液酸的受體并促進(jìn)F蛋白的融合作用。因此，HN蛋白在病毒的感染過程中扮演著重要的角色。 本研究在成功重組新城疫Lasota的基礎(chǔ)上，利用反向遺傳操作技術(shù)，將強(qiáng)毒株F48E9、HB38的HN基因替換rLasota的HN基因。提取F48E9、HB

4、38基因組RNA，利用引物經(jīng)RT-PCR獲得其HN基因的PCR產(chǎn)物。連接pBluscriptⅡKS(+/-)載體多克隆位點(diǎn)上，測序正確后，利用特定的MunI和Spe I酶切位點(diǎn)酶切得HN基因片段。構(gòu)建全長質(zhì)粒，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，收獲病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN。拯救病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN的F3代，收獲病毒陽性尿囊液提取病毒基因組RNA，進(jìn)行RT-PCR及序列分析。 嵌合病毒rL-F48E9HN、rL

5、-HB38HN在雞胚內(nèi)的生長特性與親本株Lasota一致，與F48E9、HB38的生長特性相差甚遠(yuǎn)。通過分析是否HN蛋白的來源對(duì)于NDV的生物學(xué)活性有一定的影響，以及親本毒株及嵌合病毒紅細(xì)胞吸附性和融合作用。結(jié)果表明：嵌合病毒紅細(xì)胞吸附性明顯增強(qiáng)，rL-F48E9HN、rL-HB38HN分別增加51％、62％，而融合作用無明顯變化。嵌合病毒對(duì)雞及雞胚的致病性研究表明：rL-F48E9HN、rL-HB38HN的MDT分別為148h、120