新城疫病毒流行株致病性和抗原性及其與F和HN基因變異的相關(guān)性.pdf

1、雞新城疫(Newcastledisease，ND)是由一種Ⅰ型副黏病毒一雞新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)引發(fā)的一種急性傳染病。未經(jīng)免疫的雞群，傳播性極強(qiáng)，發(fā)病和死亡率都非常高。即使一些已經(jīng)多次免疫的雞群，由NDV引發(fā)的急性和亞急性死亡仍不斷零星發(fā)生，而由新城疫引起的呼吸道感染、亞臨床感染及產(chǎn)蛋下降則更為普遍。六十年來(lái)，NDV一直是對(duì)雞群危害最大的疫病。近十年中，國(guó)內(nèi)禽病界一直試圖在分子遺傳水平闡明NDV

2、毒株的變異趨勢(shì)，在分子流行病學(xué)上己積累了大量毒株的資料和信息。但是，這些研究對(duì)信息的比較分析的深度不夠，缺乏系統(tǒng)的對(duì)病毒的生物學(xué)性狀與基因變異相關(guān)性的研究，特別是還沒(méi)有在疫病控制方面最為關(guān)心的對(duì)不同基因變異的相關(guān)性及其與抗原性變異的相關(guān)性方面開(kāi)展深入的研究。 本研究測(cè)定和比較了三十株NDV野毒株的融合蛋白(F)基因和血凝素一神經(jīng)氨酸酶(HN)基因的全基因序列，首次對(duì)大量NDV毒株的F基因、HN基因，從致病性和抗原性變異兩個(gè)方面及

3、其與基因變異的相互關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)的比較研究，獲得了以下進(jìn)展： 一、NDV的分離鑒定和蝕斑純化所用30個(gè)毒株均是1996～2005年期間從山東、江蘇等不同地區(qū)的雞、鴨、鵝、鴿等不同家禽分離，經(jīng)用已知對(duì)NDV、禽流感(H5和H9型)等單因子陽(yáng)性血清作血凝抑制試驗(yàn)(HI)證明均為NDV。同時(shí)對(duì)其中20株在細(xì)胞培養(yǎng)上完成了蝕斑純化。 二、NDV的致病性比較研究經(jīng)MDT(雞胚平均死亡時(shí)間)、ICPI(1日齡雞腦內(nèi)接種致病指數(shù))及IV

4、PI(6周齡雛雞靜脈致病指數(shù))測(cè)定試驗(yàn)，30株NDV野毒有28株為強(qiáng)毒，1株為中等毒力，另一株尚未確定。對(duì)20個(gè)已蝕斑克隆純化的病毒株的致病性作了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，各毒株克隆純化前后的毒力水平基本一致，表明分離物中的病毒組成是同源的。但有2個(gè)未能適應(yīng)細(xì)胞的毒株例外，在經(jīng)雞胚連續(xù)傳代后，與原代毒相比，一株的致病指數(shù)顯著降低(SBZ02)，而另一株(SY03)從第5代則顯著升高。這表明，有一部分原始毒可能存在著致病性不同的病毒混合物。 三、

5、NDV流行毒株的抗原性變異選擇了17個(gè)克隆化毒株和3個(gè)參考株(LaSota、Clone30和F48E9)，利用SPF雞分別制備了單因子陽(yáng)性血清，分別用HI和病毒中和反應(yīng)比較了它們與我國(guó)最廣泛應(yīng)用的Ⅱ型疫苗毒LaSota株和中國(guó)經(jīng)典強(qiáng)毒F48E9間的抗原性交叉反應(yīng)。結(jié)果表明：在我國(guó)雞群中已出現(xiàn)了在抗原性上逐漸偏離疫苗LaSota株的野毒株。 (一)不同毒株間HI交叉反應(yīng)的抗原同源性比較對(duì)20個(gè)毒株的單因子血清相互做HI交叉，根據(jù)相

6、互間交叉HI和同源性HI滴度的比較計(jì)算出交叉HI抗原同源性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：F48E9與LaSota同源性最高(0.98)，23.5％的NDV野毒與F48E9和LaSota間的同源性在0.9以上，但52.9％的NDV野毒與LaSota和F48E9的同源性己降至0.70～O.85，而且，即使同屬于基因Ⅶ型的不同毒株間抗原的同源性也變化在0.79～1.0間。 (二)不同毒株間在雞胚上的交叉中和反應(yīng)的抗原同源性比較對(duì)16個(gè)毒株的單因子血清做

7、雞胚交叉中和反應(yīng)，根據(jù)相互間交叉中和同源性中和指數(shù)的比較計(jì)算出交叉中和抗原同源性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：LaSota對(duì)F48E9的中和同源性在0.77，15％的NDV強(qiáng)毒與F48E9和LaSota間的同源性在0.5以上，85％的NDV強(qiáng)毒與LaSota和F48E9的同源性已降至O.15～0.5。 (三)不同毒株間在細(xì)胞上的交叉中和反應(yīng)的抗原同源性比較對(duì)16個(gè)毒株的單因子血清做細(xì)胞交叉中和反應(yīng)，根據(jù)相互間交叉中和同源性中和指數(shù)的比較計(jì)算出交叉

8、中和抗原同源性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：F48E9與LaSota之間中和同源性在0.63，34％的NDV強(qiáng)毒與F48E9和LaSota間的同源性在0.5以上，但66％的NDV強(qiáng)毒與LaSota和F48E9的同源性已降至O.17～0.46，而且，即使同屬于基因Ⅶ型毒株間抗原的同源性變化在0.17～0.98間。 這是國(guó)內(nèi)外第一次嘗試對(duì)足夠數(shù)量的毒株間的抗原性差異作系統(tǒng)的研究，而且用客觀(guān)量化的數(shù)據(jù)證明了我國(guó)雞群中已出現(xiàn)了與常規(guī)疫苗株有顯著抗原性差異

9、的野毒株。這可以部分解釋為什么在一些高強(qiáng)度免疫的雞群中仍有ND發(fā)生。四、F基因的基因型分布對(duì)30株NDV的F基因完成了全基因組序列測(cè)定。按照文獻(xiàn)通用的標(biāo)準(zhǔn)方法，根據(jù)F基因前374核甘酸同源性比較表明：30株NDV中，20株為基因Ⅶ型，占66.7％；6株為基因Ⅱ型，占20％，在6株基因Ⅱ型中，有5株經(jīng)生物學(xué)試驗(yàn)證明是速發(fā)型強(qiáng)毒；3株為基因Ⅸ型，占10％；1株鴿NDV為基因Ⅵ型，占3.3％。本研究在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道有一定比例的流行毒株屬基因Ⅱ型

10、而且是強(qiáng)毒。 五、F蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸序列與致病性的關(guān)系長(zhǎng)期以來(lái)，F(xiàn)0蛋白裂解位點(diǎn)前后的氨基酸序列中的堿性氨基酸數(shù)量被認(rèn)為是衡量NDV致病性的一個(gè)非常重要的相關(guān)指數(shù)。其中，不同基因型的所有強(qiáng)毒株為111GRRQKR↓F117，而以疫苗毒LaSota為代表的弱毒NDV株均為111GGRQGR↓L117。但本研究首先發(fā)現(xiàn)：有3株基因Ⅱ型的強(qiáng)毒株SQZ04、QE01、JS05的裂解位點(diǎn)是111GGRQGRL117，與弱毒株序列完全相同

11、。這表明，雖然F蛋白裂解位點(diǎn)的111GGRQGRL117與毒株的毒力密切相關(guān)，但并不是必要因素。因此，不能將它作為判定所有NDV毒力水平的最終指標(biāo)。 六、F和HN基因部分片段與全基因變異的相關(guān)性比較對(duì)我們測(cè)定的部分毒株與文獻(xiàn)中已發(fā)表的不同基因亞型的參考株的比較表明，F(xiàn)蛋白和HN蛋白的N端和C端不同片段的核甘酸和氨基酸的變異與全基因的變異有很高的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)r≥0.911)。這表明，對(duì)于全長(zhǎng)為1662nt的F基因來(lái)說(shuō)，5’端的

12、374nt的測(cè)序足以用來(lái)完成對(duì)大多數(shù)野毒株的基因分型。 七、HN基因序列比較同文獻(xiàn)報(bào)道一樣，本實(shí)驗(yàn)所有30株NDV的HN基因全長(zhǎng)均為1716bp。綜合文獻(xiàn)已發(fā)表的60多個(gè)代表毒株的HN的序列，本研究首先嘗試了以HN基因?yàn)榛A(chǔ)的對(duì)NDV的基因分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：根據(jù)HN基因可將上述毒株分為7個(gè)基因型。 八、F基因和HN基因型相關(guān)性比較對(duì)66個(gè)NDV株(包括本研究完成測(cè)序的30株)的兩個(gè)基因分型比較表明：大多數(shù)毒株的F基因型與H

13、N基因型都是相吻合的，符合率51/66(77.2％)，其中，30株本研究分離的毒株符合率僅為21/30(70％)。但14個(gè)新近分離的毒株(1990～2004)按HN基因分型同屬于一個(gè)基因型(Ⅶ)，如按F基因分型分型則屬于基因Ⅱ型的有6株，屬于基因Ⅵ的有4株，屬于Ⅸ型的有4株。意大利的一株鴿新城疫病毒株(2000)屬F基因Ⅶ型，但HN基因型為Ⅵ(其他HN基因Ⅵ型屬F基因Ⅵ型)。 九、F和HN基因同源性與其抗原同源性的相互關(guān)系統(tǒng)計(jì)學(xué)

14、分析表明：不同毒株的HN基因同源性與HI抗原同源性的相關(guān)指數(shù)(r=0.363)顯著高于F基因同源性與HI抗原同源性的相關(guān)指數(shù)(r=0.16)，更顯著高于F基因前374bp的同源性與HI抗原同源性的相關(guān)指數(shù)(r=0.012)。 不同毒株的HN基因同源性與雞胚中和反應(yīng)抗原同源性的相關(guān)指數(shù)(r=0.311)顯著高于F基因同源性與雞胚中和反應(yīng)抗原同源性的相關(guān)指數(shù)(r=0.17)，更顯著高于F基因前374bp的同源性與雞胚中和反應(yīng)抗原同源

15、性的相關(guān)指數(shù)(r=0.115)。 不同毒株的HN基因同源性與細(xì)胞中和反應(yīng)抗原同源性的相關(guān)指數(shù)(r=0.287)，顯著高于F基因同源性與細(xì)胞中和反應(yīng)抗原同源性的相關(guān)指數(shù)(r=0.202)，更顯著高于F基因前374bp的同源性與細(xì)胞中和反應(yīng)抗原同源性的相關(guān)指數(shù)(r=0.165)。 這些結(jié)果又一次清楚地證明了，在對(duì)NDV保護(hù)性免疫中，對(duì)HN蛋白的抗體反應(yīng)可能比對(duì)F蛋白的抗體反應(yīng)更為重要。多年來(lái)學(xué)術(shù)界在對(duì)NDV的分子流行病學(xué)調(diào)查

16、中一直強(qiáng)調(diào)F基因的基因分型可能是片面的，至少對(duì)疫病控制的指導(dǎo)作用不大。對(duì)疫病控制來(lái)說(shuō)，似乎HN基因型比F基因型更重要。 十、免疫選擇壓對(duì)NDV不同基因變異的影響通過(guò)比較不同毒株間的F和HN基因變異與年度的關(guān)系，在國(guó)內(nèi)外首次嘗試闡明免疫選擇壓對(duì)NDV不同基因變異的影響。 對(duì)過(guò)去近六十年中分離的野毒株的比較發(fā)現(xiàn)：近二十年來(lái)分離的NDV野毒株的HN基因與國(guó)內(nèi)外一直廣泛應(yīng)用LaSota疫苗株的同源性愈來(lái)愈小，但2001年后中國(guó)的