番茄農(nóng)桿菌介導基因轉(zhuǎn)化技術(shù)體系的優(yōu)化與番茄LeJA2基因的功能研究.pdf

1、目前，殺蟲劑和除草劑的大劑量應(yīng)用對環(huán)境造成了很大的破壞，對人類的身體和生活質(zhì)量也造成了不好的影響。高等植物在長期的進化過程中形成了復雜而精細的抗性反應(yīng)機制以抵抗昆蟲的侵害。深入認識植物對昆蟲抗性的的分子機理將會為利用植物自身的抗性建立環(huán)境友好的控制農(nóng)業(yè)害蟲的策略提供理論依據(jù)。目前所鑒定的信號分子主要包括多肽信號分子系統(tǒng)素（Systemin）以及來源于不飽和脂肪酸的植物激素茉莉酸（JA），從分子水平對二者所介導的抗性反應(yīng)過程進行遺傳學解析

2、，鑒定其中的重要組分（功能基因）并對其功能進行深入研究。本研究優(yōu)化了番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系；同時利用反向遺傳學原理，構(gòu)建了LeJA2（Lycopersicon esclenrumjasmonic acid2）的過量表達載體和RNAi表達載體，通過農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得兩種類型的轉(zhuǎn)基因苗，通過對兩種類型的轉(zhuǎn)基因苗的性狀鑒定和PPO活性的測定，對LeJA2的功能進行了初步的預測。主要研究的結(jié)果如下：
　　 1.建立了農(nóng)桿菌介導的番茄

3、遺傳轉(zhuǎn)化體系
　　 對農(nóng)桿菌介導的番茄轉(zhuǎn)化LeJA2基因系統(tǒng)進行了優(yōu)化，研究了農(nóng)桿菌侵染時間、侵染溫度和侵染濃度三個因素對番茄愈傷組織形成的影響，尋求影響基因轉(zhuǎn)化的主要因素，獲得了較好的番茄農(nóng)桿菌侵染體系。
　　 2.獲得了轉(zhuǎn)基因番茄植株
　　 以子葉為轉(zhuǎn)化受體，使用高效農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化體系將LeJA2基因和LeJA2-RANi基因?qū)敕眩@得了20株LeJA2過量表達的番茄抗性植株和35株LeJA2基因沉默

4、抗性植株，PCR檢測結(jié)果表明卡那抗性株均能擴增出1050和517bp的目的條帶，證明基因已經(jīng)整合到番茄基因組中。
　　 3.功能驗證
　　 對轉(zhuǎn)基因番茄植株P(guān)PO活性進行了初步檢測。通過PPO活性測定結(jié)果得出：植株機械損傷處理前，過量表達LeJA2基因的轉(zhuǎn)基因植株P(guān)PO染色后呈現(xiàn)深褐色，而對照和轉(zhuǎn)LeJA2-RNAi基因植株P(guān)PO染色后仍然呈現(xiàn)正常的汁液的綠色。用剪刀進行機械損傷后進行PPO染色，LeJA2基因過量表達植