豬流行性腹瀉病毒YX株的分離鑒定及其滅活疫苗免疫效力試驗(yàn)研究.pdf

1、豬流行性腹瀉（PED）是由冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種以仔豬水樣腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的接觸性腸道傳染病。豬流行性腹瀉是世界上流行最廣泛的豬病之一。近年，豬流行性腹瀉作為烈性傳染病，開始瘋狂肆虐我國(guó)廣大養(yǎng)殖戶。我國(guó)的廣東、廣西、江西、湖南、福建、浙江、安徽、江蘇、湖北、河北和山東等?。ㄗ灾螀^(qū)）均有豬流行性腹瀉的發(fā)現(xiàn)。PED在我國(guó)的流行面逐漸擴(kuò)大，對(duì)26個(gè)省市自治區(qū)的調(diào)查表明PED的總死亡率占36種疾病總死亡率的

2、1.74％。該病多發(fā)于冬春季節(jié)，但就廣東地區(qū)這個(gè)全年高濕度的環(huán)境，PED呈高發(fā)趨勢(shì)，全年均可發(fā)生，7天齡內(nèi)的新生仔豬在發(fā)生腹瀉后3?4天，通常因脫水導(dǎo)致衰竭而死亡，病死率高達(dá)100%。目前，在廣東粵西地區(qū)，豬流行性腹瀉呈高發(fā)趨勢(shì)，一旦進(jìn)入冬春季節(jié)，該病都是大規(guī)模爆發(fā)，病死率高。雖然可以采取疫苗接種方式來(lái)控制此病流行，但經(jīng)典的CV777株疫苗免疫后效果并不理想，接種過(guò)疫苗的豬場(chǎng)仍然有此病的流行。本研究主要分為下面三個(gè)部分：
　　1、

3、PEDV-YX株的分離鑒定。本研究從廣東粵西9個(gè)疑似發(fā)生腹瀉疫情的規(guī)?；i場(chǎng)采集180份病料樣本。通過(guò)在Vero細(xì)胞培養(yǎng)基中添加胰酶的方法孵育、選取1%接毒量接種 Vero單層細(xì)胞，進(jìn)行病毒分離純化，從中分離出9株未知病毒HS1、HS2、HS3、HS4、YC1、YC2、YC3、YC4和KP，經(jīng)膠體金快速診斷技術(shù)、RT-PCR擴(kuò)增、基因序列比對(duì)，確診均為豬流行性腹瀉病毒（PEDV）。通過(guò)豬體回歸試驗(yàn)，選取臨床癥狀最明顯，毒力最強(qiáng)的YC1毒

4、株作為研究對(duì)象，命名為PEDV-YX株。在胰酶總濃度為7.5ug/ml的作用下，盲傳到第8代，能觀察到細(xì)胞圓縮、聚集，空泡增多等明顯的細(xì)胞病變。
　　2、對(duì)PEDV-YX株生物學(xué)特性、中和試驗(yàn)及其TCID50測(cè)定研究。對(duì)PEDV-YX株生物學(xué)特性、中和試驗(yàn)及其TCID50研究表明，該分離株對(duì)5-BrdU不敏感，為具有囊膜的RNA病毒；對(duì)乙醚、氯仿敏感；在pH為3.0的環(huán)境下易失活；對(duì)熱敏感，在50℃條件下作用1h，病毒易失活；設(shè)計(jì)

5、特異性引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)得到與預(yù)期長(zhǎng)度一致的條帶；與PEDV抗血清中和效價(jià)為120.23；PEDV-YX F10的TCID50為10-5.67/0.1ml。
　　3、PEDV-YX株氫氧化鋁膠滅活疫苗制備及不同免疫劑量、不同免疫途徑對(duì)抗體水平的影響研究。PEDV-YX株F10經(jīng)0.3%的甲醛溶液滅活，以病毒液樣40ml+PBS40ml+20ml鋁膠佐劑的培苗方案，配制豬流行性腹瀉滅活疫苗。以口服免疫、后海穴注射免

6、疫為免疫途徑，2ml、1ml、0.5ml不同免疫劑量，研究該滅活疫苗的抗體消長(zhǎng)規(guī)律。當(dāng)免疫劑量相同時(shí)，后海穴注射免疫比口服免疫抗體效價(jià)更高，且抗體維持時(shí)間更長(zhǎng)；當(dāng)免疫途徑相同時(shí)，免疫2ml的抗體整體水平比免疫1ml的更高，免疫0.5ml的中和抗體水平最低。
　　通過(guò)分離廣東粵西地區(qū)PEDV的流行性毒株，為了解該地區(qū)流行性毒株的特性及流行情況，建立PEDV快速準(zhǔn)確的診斷方法及新型疫苗的研究提供理論依據(jù)，從而為制定有效的防控措施，促進(jìn)