山東雞新城疫病毒分離鑒定與Ⅱ+Ⅶ基因型滅活疫苗研究.pdf

1、近年來，我國新城疫(Newcastle disease，ND)的流行日益復(fù)雜，免疫失敗屢屢發(fā)生，給養(yǎng)禽業(yè)，特別是養(yǎng)雞業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。為更好地防制新城疫的發(fā)生，探索有效的防制措施，本研究對山東省雞新城疫進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，掌握了新城疫的流行狀況，并分離獲得了12個(gè)新城疫病毒流行株。在此基礎(chǔ)上，對新城疫病毒LY1分離毒株的致病性及變異性狀開展了檢測分析，然后以此分離株制備滅活疫苗進(jìn)行免疫保護(hù)試驗(yàn)，同時(shí)，構(gòu)建了新城疫病毒HN基因C

2、3dP29補(bǔ)體融合基因疫苗，探明了C3d P29基因的分子佐劑效果，為新城疫防制奠定了重要基礎(chǔ)。本研究主要包括四個(gè)部分：
　　 ⑴NDV的分離鑒定與生物學(xué)特性研究。從山東省8個(gè)地區(qū)22個(gè)養(yǎng)禽場82份疑似新城疫病料中，分離和鑒定出12株NDV。將12株NDV進(jìn)行了MDT、ICPI和IVPI檢測，結(jié)果表明，6個(gè)分離株(WF10、WF13、LY1、LY7、ZB10和JN2株)MDT均小于60h、ICPI均大于1.6、IVPI均在2.0

3、0以上，表明為強(qiáng)毒株；DY2、LC3和BZ7株的MDT分別為63.6h、69.6h和62.4h，ICPI值為1.4、1.44和1.35，IVPI值為1.74、1.85和1.49，為中毒力毒株；WF3、LY14和TA6株為弱毒株。經(jīng)動(dòng)物回歸試驗(yàn)，各毒株NDV均可導(dǎo)致雞發(fā)生不同程度的發(fā)病和死亡，且發(fā)病和死亡的雞均出現(xiàn)ND典型癥狀和剖檢變化。
　　 ⑵NOV LY1株F和HN基因的克隆與序列分析。利用RT-PCR技術(shù)，對山東省新城疫病

4、毒LY1分離株的F基因主要功能區(qū)片斷和HN基因全部的核苷酸序列進(jìn)行了克隆和序列分析。結(jié)果顯示：(1)LY1株F基因開放性閱讀框架(ORF)為1662bp，編碼489個(gè)氨基酸。與國內(nèi)外發(fā)表的部分新城疫病毒強(qiáng)毒株和弱毒株之間相同序列進(jìn)行比較，該毒株F基因核苷酸序列的同源性在84.1％～88.7％之間，氨基酸同源性在88.1％～93.3％之間；F蛋白裂解位點(diǎn)區(qū)(112～117)氨基酸組成與強(qiáng)毒株一致。從分子水平證明NDV山東分離株(LY1)為

5、新城疫強(qiáng)毒株。LY1株病毒在101位和121位分別為K(賴氨酸)、V(纈氨酸)兩種特征氨基酸，具有Ⅶ型基因型NDV的典型特征。該毒株與我國標(biāo)準(zhǔn)毒株的同源性較低，與強(qiáng)毒株F48E9的同源性只有86.3％，與新城疫標(biāo)準(zhǔn)弱毒株C30的同源性只有84.2％，說明已發(fā)生一定的變異，這可能是高抗體水平壓力下引起雞群發(fā)病的原因。(2)HN基因ORF大小為1716bp，編碼571個(gè)氨基酸。與國內(nèi)外發(fā)表的部分新城疫病毒強(qiáng)毒株和弱毒株之間相同序列進(jìn)行比較，

6、HN基因核苷酸序列的同源性在82.1％～87.4％之間，氨基酸同源性在87.6％～90.9％之間，屬于強(qiáng)毒的C群，這與該病毒生物學(xué)鑒定的結(jié)論是一致的。
　　 ⑶新城疫病毒不同基因型滅活油乳疫苗的研制及免疫效果測定。將新城疫病毒基因Ⅶ型LY1分離株和傳統(tǒng)的LaSota株(基因Ⅱ型)與油佐劑按1：3比例混合乳化，分別制成油包水型LY1分離株、LY1分離株+LaSota株油乳劑滅活苗；無菌試驗(yàn)和物理性狀檢驗(yàn)合格；雞體倍量注射試驗(yàn)結(jié)果證

7、明疫苗安全性好；用LaSota株抗原進(jìn)行HI試驗(yàn)，檢測免疫接種雞抗NDV-HI抗體，結(jié)果顯示，LY1分離株+LaSota株油乳劑滅活苗于接種后的14d、21d、28d所產(chǎn)生的平均HI抗體效價(jià)與商品化滅活疫苗(LaSota株)無明顯差異(P>0.05)，至35d后兩種疫苗的抗體效價(jià)均達(dá)到7.2Log2以上；而LY1分離株滅活疫苗組各個(gè)時(shí)期(接種后7天除外)所產(chǎn)生的平均HI抗體效價(jià)與LY1分離株+LaSota株油乳劑滅活苗組及商品化滅活疫苗

8、(LaSota株)組的抗體效價(jià)差異顯著(P<0.05)。LY1分離株+LaSota株油乳劑滅活苗組、LY1分離株滅活疫苗組和商品化滅活疫苗(LaSota株)組HI抗體效價(jià)上升規(guī)律相同，均與對照組各個(gè)時(shí)段所產(chǎn)生的平均HI抗體效價(jià)差異均極顯著(P<0.01)。免疫后4周用LY1分離株進(jìn)行了攻毒試驗(yàn)。結(jié)果證明，LY1分離株+LaSota株油乳劑滅活苗組免疫保護(hù)率可達(dá)100％，LY1分離株滅活疫苗組和商品化滅活疫苗(LaSota株)組的免疫保護(hù)

9、率分別為90％和70％。表明單純使用LaSota株商品化滅活疫苗產(chǎn)生的保護(hù)力較低，而用分離株配以LaSota株制備的不同基因型(基因Ⅱ型+基因Ⅶ型)滅活油乳疫苗則能產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)能力。
　　 ⑷雞C3d分子佐劑-NDV HN基因疫苗的構(gòu)建與免疫保護(hù)效果研究。以RT-PCR擴(kuò)增新城疫病毒LY1株的HN基因，定向克隆至真核表達(dá)載體pCDNA-P29n中P29n的上游，將雞補(bǔ)體C3d的受體結(jié)合功能區(qū)P29作為分子佐劑與新城疫病毒的HN

10、基因連接，構(gòu)建了NDVpCDNA-HN-P29.4和pCDNA-HN-P29.6分子佐劑基因疫苗，免疫接種3周齡SPF雞，結(jié)果顯示，免疫后3-4周pCDNA-HN-P29.4、pCDNA-HN-P29.6和pCDNA-HN免疫組均能誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生HI抗體，但pCDNA-HN-P29.4、pCDNA-HN-P29.6免疫組HI抗體水平明顯高于pCDNA-HN免疫組(P<0.01)，但低于商品化滅活苗免疫組。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，pCDNA-HN