豬圓環(huán)病毒2型致病機(jī)理和重組腺病毒介導(dǎo)shRNA抑制PCV2在體內(nèi)外復(fù)制的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)為圓環(huán)病毒科成員之一，在全球各地已廣泛流行，可引起多種臨床疾病，包括是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)，豬皮炎和腎病綜合征，已給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。該病毒與其它細(xì)菌或病毒(如豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒)發(fā)生混合感染，則能引起更嚴(yán)重的疾病。其致病機(jī)理研究尚不十分清楚，在我國(guó)也尚無(wú)有效控制措施。本研究從我國(guó)不同地方PCV2流行毒株的分子遺傳特性、PCV2與PRRSV共感染對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞的免疫功能兩

2、方面探討其致病機(jī)理，并利用腺病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)探討該病防治的新策略，為我國(guó)有效防治該病奠定基礎(chǔ)。 1.中國(guó)PCV2流行毒株遺傳特性研究。收集了2002-2004年全國(guó)9個(gè)省市具有PMWS臨床癥狀的仔豬病料，分別通過(guò)病理學(xué)觀察、病毒分離，并對(duì)不同來(lái)源和時(shí)間的毒株進(jìn)行全基因測(cè)序及序列分析。結(jié)果為，11株P(guān)CV2的全序列核苷酸同源性為95.1-99.7％，與GenBank中來(lái)源于不同地區(qū)、不同時(shí)間和不同疾病的49株P(guān)CV2序列進(jìn)行

3、分析比較，全基因核苷酸同源性為93.5-99.7％，ORF2核苷酸同源性為89.9-99.9％。其中與來(lái)源于健康豬群的PCV2比較，全基因核苷酸同源性為94.3-99.7％，ORF2核苷酸同源性為89.3-99.7％；與來(lái)源于其它疾病(PDNs和流產(chǎn))的PCV2全基因核苷酸同源性為94.5-99.6％，ORF2同源性為90.2-99.6％。；所有這60株P(guān)CV2的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)由兩個(gè)大分支構(gòu)成；中國(guó)PCV2毒株在兩個(gè)分支上均有分布。結(jié)果證實(shí)

4、，PCV2感染及PMWS的發(fā)生在我國(guó)豬群中已相當(dāng)普遍；中國(guó)PCV2序列與其它國(guó)家的毒株均有很近的親緣關(guān)系，但其中大部分與歐洲的毒株同源性較高；中國(guó)各地的PCV2存在多種基因型，流行毒株分子遺傳特性無(wú)時(shí)間和地域性差異。基因的差異與臨床癥狀無(wú)明顯聯(lián)系。病毒致病特性與病毒分子遺傳變異可能無(wú)直接相關(guān)性。 2.PCV2與PRRSV混合感染對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞免疫學(xué)功能的影響。首先成功建立了PCV2、PRRSV以及豬幾種細(xì)胞因子(INFα，IN

5、FFγ，TNFα，IL-8和IL-10)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，然后制備豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)，再將PAM細(xì)胞分為6組，分別接種PRRSV和PCV2，即PCV2、PRRSV、PCV2+PRRSV(先接種PCV2，12h后接種PRRSV)、PRRSV+PCV2(先接種PRRSV，12h后接種PCV2)、PRRSV/PCV2(同時(shí)接種)和Mock組。 接種后培養(yǎng)不同時(shí)間觀察細(xì)胞病變和存活率，并用Real-time PCR和IFA

6、方法檢測(cè)PAM中PRRSV和PCV2的滴度、以及細(xì)胞因子INFα、INFγ、TNFα、IL-8和IL-10的mRNA水平。結(jié)果為：①PRRSV能在PAM中增殖，并產(chǎn)生CPE；PCV2在PAM中感染率較低，無(wú)CPE。②PRRSV對(duì)PCV2增殖沒(méi)有明顯影響，而PCV2先于或同時(shí)與PRRSV感染對(duì)PRRSV的復(fù)制具有抑制作用，但PCV2后于PPRSV感染，可促進(jìn)PRRSV增殖．③PCV2單獨(dú)感染PAW后能促進(jìn)INF-α和INF吖的大量表達(dá)；P

7、RRSV單獨(dú)感染PAM初期，1NF-γ表達(dá)量增加，INF-α表達(dá)量減少，感染后期INF-α的表達(dá)量才有所上升。PCV2與PRRSV混合感染初期則使INF-α和INF-γ表達(dá)減少，感染48h后，INF-α的表達(dá)量迅速上升，并維持在較高的水平，INF-γ然有所上升，但始終維持在較低的水平。④PCV2單獨(dú)感染對(duì)TNF-α的表達(dá)量影響不大；而PRRSV感染后，TNF-α表達(dá)量持續(xù)增加，尤其是與PCV2混合感染后，TNF-α的表達(dá)量明顯增加。⑤P

8、CV2與PRRSV單獨(dú)感染后均可以刺激IL-8和IL-10大量表達(dá)，感染初期IL-8的表達(dá)量高，隨后下降，但I(xiàn)L-10的表達(dá)量一直維持在很高的水平。PRRSV+PCV2組與PCV2/PRSV組IL-8和IL-10的平均表達(dá)量均明顯增加。上述結(jié)果表明，PRRSV與PCV2體外共感染對(duì)PCV2的增殖沒(méi)有明顯影響，PRRSV感染后如果再感染PCV2，可以明顯促進(jìn)PRRSV病毒增殖，抑制體液免疫和細(xì)胞免疫，同時(shí)，兩種病毒共同刺激了TNF-α、I

9、L-8和IL-10的大量表達(dá)，抑制了抗病毒因子INF-γ的表達(dá)，從而加重了病理學(xué)免疫應(yīng)答，促進(jìn)了病理?yè)p傷。 3．腺病毒介導(dǎo)shRNA在體內(nèi)外抑制PCV2復(fù)制機(jī)理研究。 (1)靶向PCV2 ORF1和ORF2 shRNA重組腺病毒的構(gòu)建。首先，設(shè)計(jì)合成分別針對(duì)PCV2 ORF1與ORF2基因的發(fā)夾小RNA片段(shNRA)S1與S2，分別體外退火形成雙鏈，克隆入pSUPER載體中的H1啟動(dòng)子后的克隆位點(diǎn)，再將H1啟動(dòng)子連同

10、小RNA片段切下后插入重組腺病毒穿梭質(zhì)粒(pAdTrack-CMV)的多克隆位點(diǎn)，與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183內(nèi)進(jìn)行同源重組，獲得的重組腺病毒質(zhì)粒pAdS1與pAdS2經(jīng)轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞生成表達(dá)針對(duì)PCV2 ORF1與ORF2的shRNA的重組腺病毒，分別命名為：rAdS1與rAdS2。我們用相同的方法將pSUPER載體中的H1啟動(dòng)子插入腺病毒表達(dá)載體，構(gòu)建成功了對(duì)照重組腺病毒，rAdH1。 (2)重組腺病

11、毒介導(dǎo)的shRNA抑制PCV2在PK15細(xì)胞中復(fù)制的研究。將rAdS1、rAgS2和對(duì)照病毒rAdH1接種PK-15細(xì)胞，24h后再接種PCV2病毒，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)PCV2，結(jié)果為，rAdS1和rAdS2均能有效地抑制PCV2病毒的增殖，其中rAdS2抑制效率更強(qiáng)，達(dá)96％。分別通過(guò)半定量PCR，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法檢測(cè)上述試驗(yàn)中PCV2的mRNA、DNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，PCV2感

12、染后48h，重組腺病毒rAdS1與rAdS2對(duì)PCV2在PK15細(xì)胞上的復(fù)制有明顯的抑制作用，并至少持續(xù)120h，且這種抑制作用有重組腺病毒感染劑量依賴(lài)性，當(dāng)表達(dá)shRNA重組腺病毒的接種劑量增加至1000個(gè)MOI時(shí)，rAdS1與rAdS2對(duì)PCV2的抑制效率分別升至78％和96％；將這兩種重組腺病毒共同感染PK15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用具有相加性；而且用重組腺病毒接種已經(jīng)感染PCV2的PK15細(xì)胞，病毒的復(fù)制也得到部分抑制，其

13、中rAdS1與rAdS2對(duì)PCV2的DNA水平的抑制效率分別為48.8％和78.9％。 (3)重組腺病毒介導(dǎo)的shRNA抑制PCV2在小鼠體內(nèi)復(fù)制的研究。將重組病毒以10<'8>efu/只的劑量通過(guò)滴鼻與腹腔注射的方式接種BALB/c小鼠，24h后每只小鼠通過(guò)同樣的接種方式感染10<'4>TCID<,50> PCV2。感染后觀察小鼠的臨床癥狀，并在第7、14，21和28天每組分別宰殺5只小鼠，觀察肉眼病變，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方

14、法檢測(cè)小鼠脾臟及血液中PCV2的病毒含量。結(jié)果顯示，各組小鼠均未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀和肉眼病變。在陽(yáng)性對(duì)照組(PCV2單感染組)，小鼠感染PCV2后7-21天，脾臟內(nèi)PCV2病毒的滴度逐漸增加。在試驗(yàn)組，重組腺病毒rAdS1和rAdS2在感染后前1-2周對(duì)小鼠脾臟中PCV2病毒均有輕微的抑制作用，到第3、4周這種抑制作用明顯增強(qiáng)，對(duì)PCV2病毒的抑制效率可達(dá)91.4％-96.8％。結(jié)果表明，靶向PCV2基因組不同區(qū)域的shERNA可以作