南瓜SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化及南瓜無蔓性狀分子標(biāo)記研究.pdf

1、南瓜（Cucurbitaceae）是人類歷史上種植較古老的作物之一，在中國(guó)有悠久的栽培歷史，分布廣泛，被稱為世界蔬菜。南瓜具有抗逆性強(qiáng)，品種資源豐富，適應(yīng)性強(qiáng)，用途廣，耐貯存，產(chǎn)量高，果實(shí)形狀、大小、顏色、品質(zhì)各有不同，具有顯著的生物多樣性特征。同時(shí)南瓜又有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。南瓜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成全面而又獨(dú)具特色，特別是南瓜果肉中VA含量居所有瓜菜之首。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)南瓜作物的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他作物，可應(yīng)用于南瓜的分子標(biāo)記數(shù)量非

2、常有限。本研究在對(duì)南瓜SSR-PCR技術(shù)體系優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)影響南瓜產(chǎn)量的蔓性性狀進(jìn)行了分子方面研究，旨在為南瓜控制蔓性性狀基因的精細(xì)定位以及對(duì)標(biāo)記的蔓性基因進(jìn)行基因克隆提供科學(xué)依據(jù)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.為獲得高質(zhì)量的南瓜基因組DNA，通過對(duì)傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行改良，得出調(diào)整后的CTAB法:每25ml CTAB抽提緩沖液中加入0.25g PVP和1ul巰基乙醇，并用TE溶液(內(nèi)含1ul的10mg/ml的RNas

3、eA)溶解南瓜基因組DNA?？捎行p少南瓜葉中的酚類物質(zhì)、蛋白、多糖和RNA，為后續(xù)的PCR反應(yīng)提供高質(zhì)量的基因組DNA。
　　2.為獲得有效的南瓜SSR-PCR反應(yīng)體系，以南瓜無蔓突變體自交系和長(zhǎng)蔓自交系為試驗(yàn)材料，借鑒了前人對(duì)其他植物分子標(biāo)記的成功經(jīng)驗(yàn)，通過采用正交試驗(yàn)的方法對(duì)影響南瓜SSR反應(yīng)體系中的主要條件進(jìn)行研究，并設(shè)計(jì)了梯度PCR退火溫度對(duì)南瓜SSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了最佳的SSR-PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)體系為20μ

4、l，含有1.5mmol/L Mg2+,60ng DNA,0.20mmol/L dNTPs,0.25mmol/L Primer和1.5U Taq酶，梯度PCR試驗(yàn)篩選引物，得到最佳退火溫度為44.1℃。
　　3.利用篩選出的36對(duì)特異性引物對(duì)24份親本材料共擴(kuò)增出2437條帶，其中2329條表現(xiàn)多態(tài)性，占總數(shù)的95.57％。不同引物擴(kuò)增產(chǎn)物總帶數(shù)和獲得的多態(tài)性帶數(shù)差異比較大，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶從2條到8條不等，平均4條。多態(tài)性位點(diǎn)百分率最

5、高為100％，最低為35％。
　　4.利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)南瓜長(zhǎng)蔓自交系和無蔓自交系的F2代分離群體進(jìn)行遺傳分析，測(cè)得純合無蔓群體與雜合無蔓群體遺傳距離為7.2693cM，純合無蔓群體與長(zhǎng)蔓群體遺傳距離為10.1426cM，雜合無蔓群體與長(zhǎng)蔓群體遺傳距離為8.0847cM。求出LOD值大于3時(shí)有5個(gè)標(biāo)記可以有效連鎖。供試材料相似系數(shù)在閥值為0.63處正好可把F2代群體劃分為2個(gè)類群。第一類群為無蔓性狀南瓜，第二類群為長(zhǎng)蔓性狀南瓜。