抗壞血酸及鈣信號(hào)在Elicitin誘導(dǎo)煙草細(xì)胞死亡中的作用.pdf

1、植物受非親和病原物侵染或激發(fā)子等因子刺激可發(fā)生過敏性細(xì)胞死亡(hypersensitive cell death，HCD)，HCD是植物對外界刺激的一種主動(dòng)反應(yīng)。在HCD過程中，植物體發(fā)生一系列事件，如氧化迸發(fā)、離子流等，各種事件通過某些尚不完全清楚的機(jī)制，參與調(diào)節(jié)HCD的發(fā)生。 Elicitins是一類由卵菌分泌的，分子量約為10kDa的蛋白質(zhì)激發(fā)子。Elicitins有α型(酸性)和β型(堿性)，寄生疫霉(Phytophth

2、ora parasitica)產(chǎn)生的Elicitin為α型，稱為parasiticein。我們實(shí)驗(yàn)室已從煙草黑脛病菌(P.parasitica)中克隆了編碼Elicitin的基因并體外表達(dá)了該蛋白，對該激發(fā)子誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡的特征做了初步研究，本文在前期研究基礎(chǔ)，以Elicitin和煙草懸浮細(xì)胞為互作體系，探討抗氧化劑抗壞血酸(ASA)以及鈣通道在Elicitin誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡中的作用。所得結(jié)果如下： 1.抗壞血酸(ASA

3、)可減弱Elicitin誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡和H2O2的積累 用Trypan blue法測定了Elicitin誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡，100nmol/L的Elicitin處理煙草細(xì)胞后24 h，死亡率為69.6％，而ASA+Elicitin處理的細(xì)胞死亡率為46.4％，比單獨(dú)Elicitin處理的死亡率下降23.2％。 熒光光度計(jì)法測定了Elieitin誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞H2O2的變化，發(fā)現(xiàn)Elicitin誘導(dǎo)后2 h，細(xì)胞出現(xiàn)一

4、個(gè)明顯的H2O2積累，而加入抗壞血酸(ASA)后，H2O2的積累量明顯降低。表明ASA可能通過減輕煙草H2O2的積累減弱Elicitin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。 2.抗壞血酸(ASA)對Elicitin誘導(dǎo)的APX和CAT活性及其基因表達(dá)的影響 抗壞血酸過氧化物酶(APX)和過氧化物酶(CAT)是植物體內(nèi)重要的H2O2清除酶，在植物細(xì)胞內(nèi)通過清除多余的H2O2維持胞內(nèi)氧化平衡，減輕H2O2對細(xì)胞的損傷。為分析ASA是否通過影響C

5、AT和APX的活性調(diào)節(jié)H2O2的積累，測定了不同處理對兩種酶活性及其基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，未經(jīng)任何處理的煙草細(xì)胞中APX和CAT酶一直處于較高的活性狀態(tài)，而用Elicitin處理后2 h，APX和CAT活性迅速下降，在所有測定的時(shí)間段內(nèi)，兩種酶活性一直很低。與Elicitin單獨(dú)處理的情況不同，經(jīng)ASA預(yù)處理再用Elicitin誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞，APX和CAT酶活性雖然低于對照，但卻高于Elicitin誘導(dǎo)的結(jié)果。RT-PCR法檢測

6、了編碼兩種酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。這一結(jié)果說明，Elicitin誘導(dǎo)的煙草H2O2的積累可能與兩種酶活性降低有關(guān)，而ASA可能通過逆轉(zhuǎn)兩種酶活性衰減H2O2.從而減輕Elicitin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。 3.抗壞血酸(ASA)對Elicitin誘導(dǎo)的煙草hsr203J和hin1基因表達(dá)的影響 hsr203J和hin1是HCD的兩個(gè)標(biāo)志基因，采用半定量RT-PCR法分析了各處理對hsr203J和hin1表達(dá)的影響。結(jié)果

7、發(fā)現(xiàn)，Elicitin可誘導(dǎo)煙草hsr203J和hin1在轉(zhuǎn)錄水平的積累，ASA處理可減緩Elicitin對hsr203J、hin1誘導(dǎo)表達(dá)。 4.鈣離子通道抑制劑對Elicitin誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡的作用 Ca2+是植物細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)分子，對各種刺激都有明顯而快速的反應(yīng)。為了解鈣信號(hào)是否參與Elicitin誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡，選用了2種鈣離子通道抑制劑氯化鑭和EGTA，觀察其對細(xì)胞死亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯化鑭和EGT

8、A可明顯減輕Elicitin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡率，表明Elicitin誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡，可能有Ca2+的參與。 5.鈣離子通道抑制劑對Elicitin誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞產(chǎn)生活性氧及hsr203J和hinJ的影響 在煙草懸浮細(xì)胞中添加Ca2+抑制劑，熒光光度計(jì)法測定了各處理對H2O2抑制的情況。結(jié)果表明，EGTA能夠完全抑制由Elicitin引發(fā)的H2O2積累，LaCl3則只有部分抑制作用。 hsr203J和hin1是H