NO在臭氧誘導(dǎo)銀杏細(xì)胞黃酮合成積累中的信號(hào)作用.pdf

1、臭氧(O3)是大氣中一種正常的組分,存在于平流層和對(duì)流層中。高層大氣中的臭氧對(duì)地球上生物有保護(hù)作用。但臭氧在接近地面地方對(duì)生物有害,是一種污染物。隨著科技的進(jìn)步和工業(yè)的快速發(fā)展,地面臭氧濃度逐年提高,對(duì)生物,特別是植物的影響越來越大,引起了植物的產(chǎn)量和品量下降,同時(shí)對(duì)植物中遺傳物質(zhì)具有損傷作用。次生代謝產(chǎn)物的積累是植物響應(yīng)臭氧脅迫的防御方式之一,黃酮類物質(zhì)是植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物,可以清除活性氧自由基,保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu),抑制脂質(zhì)過氧化

2、等,抵御臭氧對(duì)植物的損傷。因此,植物體內(nèi)黃酮類物質(zhì)的合成積累對(duì)提高植物的臭氧耐性具有重要影響。
　　 NO是植物中一種新型的信號(hào)分子。研究報(bào)道表明NO在植物信號(hào)調(diào)控方面起著非常重要的作用,參與了包括黃酮在內(nèi)的植物次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控過程。植物在臭氧脅迫下會(huì)產(chǎn)生NO。然而,目前對(duì)NO是否參與臭氧脅迫下黃酮類次生產(chǎn)物的合成調(diào)控制過程以及臭氧脅迫下NO產(chǎn)生的機(jī)制等問題尚無詳細(xì)研究報(bào)道。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中,我們以銀杏葉細(xì)胞為材

3、料,在對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上,研究了臭氧脅迫對(duì)銀杏葉細(xì)胞中黃酮的合成和NO的產(chǎn)生的影響,并考察了NO在臭氧誘導(dǎo)黃酮合成中的功能以及硝酸還原酶(NR)在臭氧脅迫誘發(fā)NO產(chǎn)生過程的作用,主要結(jié)果如下:
　　 1、培養(yǎng)基對(duì)銀杏細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。選擇銀杏懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)迅速的MS培養(yǎng)基,添加0.5 mg/L NAA、1.0 mg/L BA、0.1 mg/L2,4-D的激素,30 mg/L的蔗糖優(yōu)化培養(yǎng)基。
　　 2、培養(yǎng)條件對(duì)

4、對(duì)銀杏細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。選擇pH5.9、25℃、100r/min優(yōu)化銀杏懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件3、高產(chǎn)銀杏細(xì)胞系的選擇。選擇了培養(yǎng)6 d的新鮮、疏松程度適當(dāng)、分散均勻、生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)好的銀杏高產(chǎn)細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。
　　 4、臭氧誘導(dǎo)對(duì)銀杏細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成積累的影響。將培養(yǎng)了6 d的的銀杏葉細(xì)胞用臭氧處理后測(cè)定銀杏葉細(xì)胞黃酮類物質(zhì)的含量,結(jié)果顯示處理后15 h到35 h內(nèi),與對(duì)照組相比,黃酮的產(chǎn)量顯著提高,其中臭氧處理30 h時(shí),黃酮的產(chǎn)量達(dá)到

5、最高,是對(duì)照組的3.2倍。表明臭氧處理可以誘發(fā)銀杏細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成積累。
　　 5、不同濃度的臭氧對(duì)銀杏細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成積累的影響。將培養(yǎng)了6 d的銀杏細(xì)胞用50 nl/L、100 nl/L、150 nl/L三種不同濃度的臭氧處理30 h后測(cè)定銀杏細(xì)胞黃酮類物質(zhì)的含量,結(jié)果表明黃酮類物質(zhì)含量分別是對(duì)照的1.2倍1.9倍和3.1倍。
　　 6、臭氧誘導(dǎo)對(duì)銀杏細(xì)胞中NO含量的影響。將培養(yǎng)了6 d的的銀杏細(xì)胞用150

6、nl/L的臭氧處理后測(cè)定銀杏葉細(xì)胞NO含量,結(jié)果顯示處理后0 h到35 h內(nèi),NO含量迅速提高,其中臭氧處理15 h時(shí),NO含量提高達(dá)到最大,為對(duì)照的16倍,表明臭氧處理可以提高銀杏細(xì)胞中NO含量。
　　 7、NO淬滅劑(cPTIO)對(duì)臭氧誘發(fā)銀杏細(xì)胞黃酮合成的抑制作用。在臭氧處理前20 min加入cPTIO(0.5 mmol/L),30 h后測(cè)定銀杏細(xì)胞黃酮含量。結(jié)果表明,加入cPTIO可以顯著抑制臭氧對(duì)銀杏細(xì)胞中黃酮合成積累

7、的誘導(dǎo)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明,cPTIO本身對(duì)銀杏細(xì)胞中黃酮合成積累無顯著影響。因此,上述試驗(yàn)結(jié)果表明NO是臭氧誘發(fā)銀杏細(xì)胞中黃酮合成積累所必需的信號(hào)分子。
　　 8、臭氧處理對(duì)銀杏細(xì)胞中硝酸還原酶(NR)活性的影響。將培養(yǎng)了6 d的的銀杏細(xì)胞用150 nl/L的臭氧處理后測(cè)定銀杏葉細(xì)胞NR活性,結(jié)果顯示處理后0 h到35 h內(nèi),以未經(jīng)臭氧處理的銀杏細(xì)胞為對(duì)照,NR活性顯著提高,其中臭氧處理10 h時(shí),NR活性提高達(dá)到最大,為加

8、了對(duì)照的3.9倍,表明臭氧處理可以提高銀杏細(xì)胞中的NR活性。
　　 9、硝酸還原酶抑制劑對(duì)臭氧誘導(dǎo)銀杏細(xì)胞NO合成的影響。在臭氧處理前20 min加入兩種硝酸還原酶抑制劑TUN(0.1 mmol/L)和Gln(20 mmol/L),10 h和15 h后分別測(cè)定銀杏細(xì)胞NR活性和NO含量。結(jié)果表明,TUN和Gln在抑制銀杏細(xì)胞中NR活性的同時(shí)還顯著抑制了臭氧對(duì)銀杏細(xì)胞中NO產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用。試驗(yàn)結(jié)果表明臭氧脅迫誘發(fā)銀杏細(xì)胞中NO的產(chǎn)

9、生對(duì)NR具有依賴性,即臭氧可能依賴NR途徑誘導(dǎo)銀杏細(xì)胞中NO的產(chǎn)生。
　　 10、硝酸還原酶抑制劑對(duì)臭氧誘導(dǎo)銀杏細(xì)胞黃酮合成的影響。在臭氧處理前20 min加入兩種硝酸還原酶抑制劑TUN(0.1 mmol/L)和Gln(20 mmol/L),30 h后測(cè)定銀杏細(xì)胞中黃酮含量,考查NR在臭氧誘導(dǎo)細(xì)胞黃酮合成的作用。結(jié)果表明,TUN和Gin處理可以顯著抑制臭氧對(duì)銀杏細(xì)胞中黃酮合成積累的誘導(dǎo)作用,表明NR參與臭氧誘發(fā)銀杏細(xì)胞中黃酮合成

10、的調(diào)控過程。由于本文試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)NR可以介導(dǎo)臭氧誘發(fā)銀杏細(xì)胞中NO產(chǎn)生,而NO是臭氧誘導(dǎo)銀杏細(xì)胞黃酮合成所必需的信號(hào)分子,因此,推測(cè)NR通過介導(dǎo)NO的產(chǎn)生而參與臭氧對(duì)銀杏細(xì)胞中黃酮合成的調(diào)控。
　　 11、硝酸還原酶抑制劑對(duì)臭氧誘導(dǎo)銀杏細(xì)胞中黃酮合成抑制作用可以通過加入N0供體硝普鈉(SNP)解除。在臭氧處理前20 min以NO供體硝普鈉(SNP,10μmol/L)和NR抑制劑同時(shí)處理銀杏細(xì)胞,30 h后測(cè)定銀杏細(xì)胞中黃酮含量,

11、考查外源添加NO對(duì)TUN和Gln對(duì)臭氧誘導(dǎo)銀杏細(xì)胞黃酮合成抑制作用的影響。結(jié)果表明,添加10μmol/L SNP后細(xì)胞中黃酮含量分別增加了64.4％、52.2％,說明添加外源NO可以逆轉(zhuǎn)NR抑制劑對(duì)銀杏細(xì)胞中黃酮合成積累的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)NR通過介導(dǎo)NO產(chǎn)生參與臭氧對(duì)銀杏細(xì)胞中黃酮合成積累調(diào)控作用的推論。
　　 綜上所述,本文試驗(yàn)結(jié)果表明臭氧脅迫下銀杏細(xì)胞可以通過NR途徑介導(dǎo)NO產(chǎn)生,而NO作為一種重要的信號(hào)分子參與