NO在臭氧誘導銀杏細胞黃酮合成積累中的信號作用.pdf

1、臭氧(O3)是大氣中一種正常的組分,存在于平流層和對流層中。高層大氣中的臭氧對地球上生物有保護作用。但臭氧在接近地面地方對生物有害,是一種污染物。隨著科技的進步和工業(yè)的快速發(fā)展,地面臭氧濃度逐年提高,對生物,特別是植物的影響越來越大,引起了植物的產(chǎn)量和品量下降,同時對植物中遺傳物質(zhì)具有損傷作用。次生代謝產(chǎn)物的積累是植物響應(yīng)臭氧脅迫的防御方式之一,黃酮類物質(zhì)是植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物,可以清除活性氧自由基,保護細胞結(jié)構(gòu),抑制脂質(zhì)過氧化

2、等,抵御臭氧對植物的損傷。因此,植物體內(nèi)黃酮類物質(zhì)的合成積累對提高植物的臭氧耐性具有重要影響。
　　 NO是植物中一種新型的信號分子。研究報道表明NO在植物信號調(diào)控方面起著非常重要的作用,參與了包括黃酮在內(nèi)的植物次生代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控過程。植物在臭氧脅迫下會產(chǎn)生NO。然而,目前對NO是否參與臭氧脅迫下黃酮類次生產(chǎn)物的合成調(diào)控制過程以及臭氧脅迫下NO產(chǎn)生的機制等問題尚無詳細研究報道。
　　 在本實驗中,我們以銀杏葉細胞為材

3、料,在對細胞培養(yǎng)條件進行優(yōu)化的基礎(chǔ)上,研究了臭氧脅迫對銀杏葉細胞中黃酮的合成和NO的產(chǎn)生的影響,并考察了NO在臭氧誘導黃酮合成中的功能以及硝酸還原酶(NR)在臭氧脅迫誘發(fā)NO產(chǎn)生過程的作用,主要結(jié)果如下:
　　 1、培養(yǎng)基對銀杏細胞生長的影響。選擇銀杏懸浮細胞生長迅速的MS培養(yǎng)基,添加0.5 mg/L NAA、1.0 mg/L BA、0.1 mg/L2,4-D的激素,30 mg/L的蔗糖優(yōu)化培養(yǎng)基。
　　 2、培養(yǎng)條件對

4、對銀杏細胞生長的影響。選擇pH5.9、25℃、100r/min優(yōu)化銀杏懸浮細胞培養(yǎng)條件3、高產(chǎn)銀杏細胞系的選擇。選擇了培養(yǎng)6 d的新鮮、疏松程度適當、分散均勻、生長態(tài)勢好的銀杏高產(chǎn)細胞進行試驗。
　　 4、臭氧誘導對銀杏細胞中黃酮類物質(zhì)合成積累的影響。將培養(yǎng)了6 d的的銀杏葉細胞用臭氧處理后測定銀杏葉細胞黃酮類物質(zhì)的含量,結(jié)果顯示處理后15 h到35 h內(nèi),與對照組相比,黃酮的產(chǎn)量顯著提高,其中臭氧處理30 h時,黃酮的產(chǎn)量達到

5、最高,是對照組的3.2倍。表明臭氧處理可以誘發(fā)銀杏細胞中黃酮類物質(zhì)合成積累。
　　 5、不同濃度的臭氧對銀杏細胞中黃酮類物質(zhì)合成積累的影響。將培養(yǎng)了6 d的銀杏細胞用50 nl/L、100 nl/L、150 nl/L三種不同濃度的臭氧處理30 h后測定銀杏細胞黃酮類物質(zhì)的含量,結(jié)果表明黃酮類物質(zhì)含量分別是對照的1.2倍1.9倍和3.1倍。
　　 6、臭氧誘導對銀杏細胞中NO含量的影響。將培養(yǎng)了6 d的的銀杏細胞用150

6、nl/L的臭氧處理后測定銀杏葉細胞NO含量,結(jié)果顯示處理后0 h到35 h內(nèi),NO含量迅速提高,其中臭氧處理15 h時,NO含量提高達到最大,為對照的16倍,表明臭氧處理可以提高銀杏細胞中NO含量。
　　 7、NO淬滅劑(cPTIO)對臭氧誘發(fā)銀杏細胞黃酮合成的抑制作用。在臭氧處理前20 min加入cPTIO(0.5 mmol/L),30 h后測定銀杏細胞黃酮含量。結(jié)果表明,加入cPTIO可以顯著抑制臭氧對銀杏細胞中黃酮合成積累

7、的誘導作用。實驗結(jié)果同時表明,cPTIO本身對銀杏細胞中黃酮合成積累無顯著影響。因此,上述試驗結(jié)果表明NO是臭氧誘發(fā)銀杏細胞中黃酮合成積累所必需的信號分子。
　　 8、臭氧處理對銀杏細胞中硝酸還原酶(NR)活性的影響。將培養(yǎng)了6 d的的銀杏細胞用150 nl/L的臭氧處理后測定銀杏葉細胞NR活性,結(jié)果顯示處理后0 h到35 h內(nèi),以未經(jīng)臭氧處理的銀杏細胞為對照,NR活性顯著提高,其中臭氧處理10 h時,NR活性提高達到最大,為加

8、了對照的3.9倍,表明臭氧處理可以提高銀杏細胞中的NR活性。
　　 9、硝酸還原酶抑制劑對臭氧誘導銀杏細胞NO合成的影響。在臭氧處理前20 min加入兩種硝酸還原酶抑制劑TUN(0.1 mmol/L)和Gln(20 mmol/L),10 h和15 h后分別測定銀杏細胞NR活性和NO含量。結(jié)果表明,TUN和Gln在抑制銀杏細胞中NR活性的同時還顯著抑制了臭氧對銀杏細胞中NO產(chǎn)生的誘導作用。試驗結(jié)果表明臭氧脅迫誘發(fā)銀杏細胞中NO的產(chǎn)

9、生對NR具有依賴性,即臭氧可能依賴NR途徑誘導銀杏細胞中NO的產(chǎn)生。
　　 10、硝酸還原酶抑制劑對臭氧誘導銀杏細胞黃酮合成的影響。在臭氧處理前20 min加入兩種硝酸還原酶抑制劑TUN(0.1 mmol/L)和Gln(20 mmol/L),30 h后測定銀杏細胞中黃酮含量,考查NR在臭氧誘導細胞黃酮合成的作用。結(jié)果表明,TUN和Gin處理可以顯著抑制臭氧對銀杏細胞中黃酮合成積累的誘導作用,表明NR參與臭氧誘發(fā)銀杏細胞中黃酮合成

10、的調(diào)控過程。由于本文試驗結(jié)果證實NR可以介導臭氧誘發(fā)銀杏細胞中NO產(chǎn)生,而NO是臭氧誘導銀杏細胞黃酮合成所必需的信號分子,因此,推測NR通過介導NO的產(chǎn)生而參與臭氧對銀杏細胞中黃酮合成的調(diào)控。
　　 11、硝酸還原酶抑制劑對臭氧誘導銀杏細胞中黃酮合成抑制作用可以通過加入N0供體硝普鈉(SNP)解除。在臭氧處理前20 min以NO供體硝普鈉(SNP,10μmol/L)和NR抑制劑同時處理銀杏細胞,30 h后測定銀杏細胞中黃酮含量,

11、考查外源添加NO對TUN和Gln對臭氧誘導銀杏細胞黃酮合成抑制作用的影響。結(jié)果表明,添加10μmol/L SNP后細胞中黃酮含量分別增加了64.4％、52.2％,說明添加外源NO可以逆轉(zhuǎn)NR抑制劑對銀杏細胞中黃酮合成積累的抑制作用。實驗結(jié)果進一步證實NR通過介導NO產(chǎn)生參與臭氧對銀杏細胞中黃酮合成積累調(diào)控作用的推論。
　　 綜上所述,本文試驗結(jié)果表明臭氧脅迫下銀杏細胞可以通過NR途徑介導NO產(chǎn)生,而NO作為一種重要的信號分子參與