胞質(zhì)鈣離子穩(wěn)態(tài)在酵母鋁誘導(dǎo)細胞死亡中的調(diào)控作用.pdf

1、鋁(Al)毒是酸性土壤中限制作物生長和產(chǎn)量的重要因素之一，近年來，在脅迫植物生理學領(lǐng)域，針對Al毒和耐Al的分子機制研究取得重大進展。植物在進化過程中產(chǎn)生了兩種重要的抗Al毒機制，分別是Al的外部排斥和內(nèi)部耐受。其中，程序性細胞死亡(PCD)的負調(diào)控也是一種Al的內(nèi)部耐受機制。Al3+在誘導(dǎo)釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)凋亡發(fā)生時，伴隨著胞質(zhì)鈣離子(Ca2+)水平的上升，而在酵母中過量表達凋亡抑制因子時，胞

2、質(zhì)Ca2+水平下降。但是胞質(zhì)Ca信號在PCD中的調(diào)控作用及其抗Al毒的內(nèi)部耐受機制仍不清楚。本論文研究了釀酒酵母液泡Ca2+泵Ca2+-ATPase Pmc1p、細胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA-AM和凋亡抑制因子調(diào)控胞質(zhì)Ca2+水平的功能以及胞質(zhì)Ca2+濃度及其穩(wěn)態(tài)在Al3+誘導(dǎo)酵母細胞死亡中的調(diào)控作用。取得主要結(jié)果如下：
　　 1.通過測定一系列酵母Ca2+通道突變體的Al毒敏感性，發(fā)現(xiàn)與野生型和其它Ca2+通道突變體相比，液

3、泡Ca2+-ATPase PMC1的突變體(pmc1)對Al毒更加敏感。
　　 2.在Al3+處理條件下，野生型和pmc1突變體菌株都發(fā)生了細胞凋亡，而且pmc1突變體發(fā)生凋亡的細胞數(shù)目顯著多于野生型，說明pmc1突變體由于液泡Ca2+通道異常，失去利用液泡調(diào)節(jié)胞質(zhì)Ca2+水平的功能，引起胞質(zhì)Ca2+濃度增加，促進PCD發(fā)生。暗示胞質(zhì)Ca信號上升是Al3+誘導(dǎo)酵母細胞發(fā)生PCD的一個早期事件。
　　 3.為了分析pmc1

4、突變體對Al毒敏感是否具有特異性，進一步用可以誘導(dǎo)酵母細胞發(fā)生凋亡的其它脅迫因子山梨醇、銅離子(Cu2+)和鎘離子(Cd2+)作實驗，結(jié)果表明pmc1突變體只對Ca和Al脅迫敏感。
　　 4.野生型和pmc1突變體細胞在不同pH值的培養(yǎng)基上生長能力相似，pH的變化幾乎沒有改變胞質(zhì)Ca2+水平。而在Al處理條件下，pmc1突變體比野生型對Al毒更加敏感。說明pmc1突變體和野生型酵母在Al脅迫下產(chǎn)生的差異是由Al毒引起的而不是由于

5、加入Al3+降低培養(yǎng)基pH值所引起的。
　　 5.為了研究PMC1能否緩解pmc1突變體對Al毒的敏感性，構(gòu)建了PMC1的表達載體并將其轉(zhuǎn)到野生型和pmc1突變體菌株中。結(jié)果表明，在Ca、Al脅迫處理下，過量表達PMC1的菌株胞質(zhì)Ca2+水平降低，從而增強了對Ca和Al脅迫的耐受性。
　　 6.胞內(nèi)Ca2+螯合劑BAPTA-AM的實驗表明，在1mM Al3+處理酵母細胞時，胞內(nèi)Ca2+水平隨加入BAPTA-AM濃度的增加

6、而呈下降的趨勢，并且BAPTA-AM的加入使酵母細胞存活率上升。說明BAPTA-AM可以抑制胞質(zhì)過多的游離Ca2+，緩解Al對酵母的毒害作用。證實了Al3+誘導(dǎo)酵母細胞死亡是通過胞內(nèi)Ca信號波動和Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)控的。抑制Al3+誘導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+的上升可以降低Al對細胞的毒害作用。
　　 7.為了研究凋亡抑制因子能否緩解pmc1突變體對Al毒的敏感性，將凋亡抑制基因(Bcl-2、Ced-9或PpBI-1)轉(zhuǎn)入野生型和pmc1突變體

7、菌株中。結(jié)果表明，在Al3+處理條件下，轉(zhuǎn)基因酵母細胞中Al3+誘導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+上升的水平明顯低于對照細胞，表達Bcl-2、Ced-9或PpBI-1的轉(zhuǎn)基因酵母細胞對Al脅迫的耐受性提高，說明Al3+誘導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+水平上升可以被抗凋亡蛋白所抑制，凋亡抑制因子能夠部分彌補Ca2+-ATPase PMC1的功能。因此，可以通過對PCD的負調(diào)控調(diào)節(jié)胞質(zhì)Ca2+穩(wěn)態(tài)，從而緩解Al對細胞的毒害作用。
　　 8.為了研究Ca信號的分子機制