粘質(zhì)沙雷氏菌次生代謝產(chǎn)物靈菌紅素的生理與生物學(xué)活性的研究.pdf

1、靈菌紅素prodiginine是含有三個(gè)吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)的天然紅色素家族的統(tǒng)稱，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗原蟲、抗瘧疾、抗腫瘤及免疫抑制等多種生物學(xué)活性并可作為天然染料，應(yīng)用前景廣泛。然而由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同，靈菌紅素表現(xiàn)出的生物學(xué)活性有較大的差異。本研究從靈菌敗血癥病蠶血淋巴中分離得到一株產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌SCQ1。首先，利用SCQ1為家蠶病原微生物的特性，以蠶蛹為主要碳氮源，優(yōu)化發(fā)酵條件提高靈菌紅素產(chǎn)量，純化并鑒定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。其次，結(jié)合

2、靈菌紅素的理化性質(zhì)研究并提出了靈菌紅素生理學(xué)功能的假說(shuō)。最后，研究了SCQ1菌株靈菌紅素抗細(xì)菌、抗真菌、抗癌以及抗家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedroviruses，BmNPV)的生物學(xué)活性。
　　1.粘質(zhì)沙雷氏菌SCQ1的分離、鑒定與發(fā)酵
　　靈菌紅素產(chǎn)量較小，目前國(guó)際市場(chǎng)上僅有標(biāo)準(zhǔn)品出售，價(jià)格約為500 USD/mg，嚴(yán)重制約了其應(yīng)用開發(fā)。本研究從靈菌敗血癥病蠶血淋巴中分離得到產(chǎn)紅色

3、素菌株SCQ1，經(jīng)鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌，并通過科赫法則進(jìn)行驗(yàn)證。經(jīng)單因子試驗(yàn)確定SCQ1菌株的最適培養(yǎng)溫度為28℃C，最適pH為6.5-8.0，發(fā)酵時(shí)間為56h，最適碳源為甘油，最適氮源為酵母膏，微量元素中鈣元素可提高紅色素產(chǎn)量。進(jìn)一步通過最陡爬坡試驗(yàn)分別確定甘油、酵母膏和鈣元素的最適范圍，采用Box-Behnken法設(shè)計(jì)3因子試驗(yàn)，建立二次響應(yīng)面回歸模型，分析得到培養(yǎng)基最佳配方為14.25 g/L甘油、14.02 g/L酵母膏和25.7

4、5μmol/L CaCl2，紅色素理論最高產(chǎn)量為986.78 mg/L。紅色素實(shí)際產(chǎn)量經(jīng)驗(yàn)證為974.76±15.33 mg/L，是初始發(fā)酵培養(yǎng)基的2.04倍。
　　為了降低靈菌紅素發(fā)酵的生產(chǎn)成本，本研究利用SCQ1菌株為家蠶致病菌這一特性，選擇蠶蛹作為主要碳氮源發(fā)酵產(chǎn)紅色素。通過測(cè)量生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)SCQ1菌株在只含蠶蛹勻漿液的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至112 h，但紅色素產(chǎn)量相對(duì)較高，約為667.23±15.33mg/L，因

5、此采用添加碳氮源的方式加速SCQ1菌株的發(fā)酵進(jìn)程。單因子試驗(yàn)確定最適氮源為酵母膏，最適碳源為蔗糖，發(fā)酵時(shí)間為72 h。通過最陡爬坡試驗(yàn)確定上述因素的最適范圍，Box-Behnken法設(shè)計(jì)3因子試驗(yàn)，建立二次響應(yīng)面回歸模型，分析得到培養(yǎng)基最佳配方為酵母膏6.36 g/L，蔗糖4.22 g/L，蠶蛹勻漿液16.24 g/L，紅色素理論最高產(chǎn)量為2，020.66 mg/L。紅色素實(shí)際產(chǎn)量經(jīng)驗(yàn)證為1，916.08±13.33 mg/L，是未優(yōu)化

6、蠶蛹培養(yǎng)基的2.87倍，是優(yōu)化后酵母膏甘油培養(yǎng)基的1.97倍。本研究分離得到的粘質(zhì)沙雷氏菌SCQ1菌株適合發(fā)酵蠶蛹生產(chǎn)靈菌紅素，產(chǎn)量約為1.9 g/L，有希望作為工業(yè)發(fā)酵菌株，也有利于蠶蛹資源的綜合利用。
　　2.靈菌紅素的分離、純化與檢測(cè)
　　靈菌紅素家族包含多種結(jié)構(gòu)類似物，本研究純化并檢測(cè)了家蠶靈菌敗血癥病原菌SCQ1菌株所產(chǎn)靈菌紅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)證實(shí)靈菌紅素不溶于水，主要存在于發(fā)酵液沉淀中，通過甲醇氯仿混合液(95∶

7、5，v/v)萃取菌體沉淀可獲得靈菌紅素粗提物。以石油醚乙酸乙酯(1∶1，v/v)為層析液進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)，紅色素Rf值約為0.6左右，與靈菌紅素prodigiosin的報(bào)道相符。采用柱色譜進(jìn)行純化，經(jīng)真空濃縮，冷凍干燥后得深紅色，表面具有綠色反光的高純度靈菌紅素固體。研究顯示，靈菌紅素在pH2-3的溶液中為紫紅色，pH7.2-7.4為橙紅色，pH10-12為黃色，其最大吸收峰隨顏色的變化發(fā)生偏移。高效液相色譜檢測(cè)顯示所制備的靈菌紅素樣品

8、純度約為95.8％，質(zhì)譜分析顯示靈菌紅素樣品可能存在結(jié)構(gòu)極其相似的同系物。進(jìn)一步通過高分辨傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜分析，確定樣品分子量[M+H]+324.2071，與靈菌紅素prodigiosin(C20H25N3O)一致。原子吸收光譜檢測(cè)顯示，每克靈菌紅素樣品中約含38.4μg鈣元素，并含有其它痕量元素。試驗(yàn)確定了家蠶病原粘質(zhì)沙雷氏菌SCQ1所產(chǎn)紅色素的主要成分為prodigiosin(CAS No.82-89-3)，為其應(yīng)用提供了

9、基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　3.粘質(zhì)沙雷氏菌靈菌紅素的生理學(xué)功能
　　許多微生物能產(chǎn)生含有吡咯結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物，如prodiginine和tambjamine，但這些代謝產(chǎn)物的生理學(xué)功能尚不清楚，未得到合理的解釋。本研究通過顯色反應(yīng)定性判斷靈菌紅素與多種金屬離子可在中性pH條件下發(fā)生作用，并發(fā)現(xiàn)靈菌紅素的鋅離子配合物具有顯著的黃色至橙色熒光效應(yīng)，推測(cè)靈菌紅素可絡(luò)合金屬離子，可能與粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)金屬離子的耐受性有關(guān)。進(jìn)一步采用平板擴(kuò)散試

10、驗(yàn)，通過對(duì)比無(wú)色素SCQ1-W突變株，發(fā)現(xiàn)靈菌紅素可在一定程度上提高粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)過量Cu2+的耐受性。然而菌體內(nèi)富集高濃度的金屬離子或累積過量的靈菌紅素顯然具有一定的毒性，因此我們研究了靈菌紅素的存在形式與分泌方式。結(jié)果顯示，靈菌紅素在粘質(zhì)沙雷氏菌的菌落中分布不均勻，其中在菌落中心表層可以固體形式析出，整體呈年輪狀分布，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間可觀察到靈菌紅素分泌至菌落外。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)靈菌紅素在菌落內(nèi)集中分布于類似囊泡的結(jié)構(gòu)中，并首次觀察到靈菌紅素

11、在特定生長(zhǎng)階段以色素團(tuán)的形式分泌至菌落外。色素團(tuán)在培養(yǎng)基表層移動(dòng)一定距離后破裂，內(nèi)部包含的靈菌紅素緩慢擴(kuò)散。研究表明靈菌紅素并不在菌體內(nèi)累積，而是通過特殊的方式分泌至體外，可能與金屬離子的代謝密切相關(guān)。隨后，我們發(fā)現(xiàn)正常培養(yǎng)條件下，粘質(zhì)沙雷氏菌分泌至菌落外的靈菌紅素，以及外源添加的高濃度靈菌紅素不影響菌落生長(zhǎng)，表明胞外高純度的靈菌紅素對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌無(wú)抑制作用。最后，我們通過添加Mn2+(促進(jìn)菌體生長(zhǎng))或Cu2+(抑制菌體生長(zhǎng))，發(fā)現(xiàn)靈菌

12、紅素涉及細(xì)菌菌落中金屬離子的傳遞。一方面，靈菌紅素傳遞有害的Cu2+至菌落外，菌落接觸后生長(zhǎng)受到抑制并在邊緣處形成凹陷，隨后在菌落內(nèi)部形成中空無(wú)菌區(qū)域。另一方面，靈菌紅素同樣可傳遞有利的Mn2+至菌落外，菌落接觸后生長(zhǎng)受到刺激并形成明顯凸起。
　　上述結(jié)果表明，粘質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素有助于提高對(duì)金屬離子的耐受性，同時(shí)有助于金屬離子在菌群內(nèi)的傳輸與分配。據(jù)此，本研究首次提出靈菌紅素具有結(jié)合并傳遞金屬離子的生理功能，即靈菌紅素是粘質(zhì)

13、沙雷氏菌金屬離子儲(chǔ)存庫(kù)的假說(shuō)，其生理學(xué)意義是提高細(xì)菌對(duì)微量元素的競(jìng)爭(zhēng)力與環(huán)境的適應(yīng)性。
　　4.粘質(zhì)沙雷氏菌靈菌紅素的抗菌與抗癌活性
　　國(guó)際上對(duì)靈菌紅素prodigiosin(C20H25N3O)抗菌活性的報(bào)道不一致，可歸咎于被測(cè)菌株、純化方法及測(cè)試方法差異等多種原因。鑒于部分產(chǎn)靈菌紅素微生物可產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)，而大量研究采用靈菌紅素粗提物進(jìn)行抗菌試驗(yàn)，結(jié)果可能存在假陽(yáng)性。本研究采用純化的靈菌紅素，結(jié)果顯示對(duì)金黃色葡萄球菌

14、、糞腸球菌、大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、耐藥性大腸桿菌等多株臨床病原細(xì)菌以及枯草芽孢桿菌均無(wú)顯著抑制作用。靈菌紅素對(duì)白色假絲酵母和疣狀瓶霉有輕微抑制作用，對(duì)新型隱球菌、構(gòu)巢曲霉和尖端賽多孢子菌無(wú)抑制作用。因此，靈菌紅素prodigiosin(C20H25N3O)對(duì)多種臨床病原細(xì)菌和真菌均沒有顯著的抑制作用，其抗菌活性不值得作為新型抗生素加以開發(fā)。
　　根據(jù)2012年中國(guó)癌癥登記年報(bào)，肺癌、胃癌、結(jié)直腸

15、癌、肝癌和食管癌是我國(guó)高發(fā)癌癥，分別占癌癥發(fā)病人數(shù)的18.74％、12.67％、10.30％、10.04％和7.74％，其中死亡率最高的3種癌癥分別是肺癌、肝癌和胃癌。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，靈菌紅素prodigiosin對(duì)不同癌細(xì)胞的抗癌活性存在顯著差異，而目前尚不知prodigiosin(CAS No.82-89-3)對(duì)多個(gè)癌細(xì)胞系，如對(duì)胃癌細(xì)胞系MGC803和SGC7901等的活性強(qiáng)弱，也不知其對(duì)人體正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性大小。本研究顯示靈菌紅

16、素對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，肝癌細(xì)胞系HepG2，胃癌細(xì)胞系MGC803及SGC7901有顯著的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度分別為6.81，8.23，15.62，0.37μmol/L。美國(guó)癌癥研究所公布的數(shù)據(jù)顯示，靈菌紅素對(duì)60株人癌細(xì)胞系的平均半數(shù)抑制濃度約為2.08μmol/L。本研究發(fā)現(xiàn)靈菌紅素對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞半數(shù)抑制濃度約為26.93μmol/L，暗示靈菌紅素對(duì)癌細(xì)胞存在選擇性細(xì)胞毒性。通過連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)靈菌紅素可快速進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)并

17、大量累積，進(jìn)一步通過流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)靈菌紅素可誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，但凋亡細(xì)胞比例始終維持在較低水平而死亡細(xì)胞比例快速提高。其中靈菌紅素為5 mg/L時(shí)，A549細(xì)胞死亡率可從4h的11.2％急劇上升至20h的94.3％。
　　我們的研究發(fā)現(xiàn)家蠶病原粘質(zhì)沙雷氏菌的靈菌紅素prodigiosin(CAS No.82-89-3)對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的毒性較低，證實(shí)其對(duì)癌細(xì)胞具有選擇性的細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡并在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致癌細(xì)胞

18、死亡。
　　5.粘質(zhì)沙雷氏菌靈菌紅素抗BmNPV的活性
　　BmNPV是家蠶最常見的病原微生物之一，可導(dǎo)致家蠶罹患血液型膿病，給養(yǎng)蠶業(yè)帶來(lái)巨大損失。家蠶血液型膿病的大面積爆發(fā)往往由少數(shù)患病個(gè)體造成，而病毒多角體的釋放是BmNPV在群體內(nèi)傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。體外試驗(yàn)顯示，靈菌紅素在安全濃度范圍內(nèi)對(duì)BmNPV有獨(dú)特的抑制作用:低濃度(10 nmol/L)時(shí)可抑制多角體形成，保護(hù)感染細(xì)胞不被裂解;高濃度(300-600 nmol/L)

19、時(shí)可快速殺死感染細(xì)胞。盡管細(xì)胞存活率差異巨大，試驗(yàn)顯示靈菌紅素可有效抑制BmNPV多角體的形成。靈菌紅素濃度為300 nmol。時(shí)，在12h內(nèi)即可殺死超過70％的感染細(xì)胞，24 h后導(dǎo)致90％左右的感染細(xì)胞死亡。體內(nèi)試驗(yàn)顯示，健康家蠶平均每只經(jīng)口添飼10 mg靈菌紅素時(shí)不表現(xiàn)出明顯的急性毒性，但可導(dǎo)致血液型膿病病蠶提前約48 h死亡，死亡個(gè)體中僅有17.59％±7.46％可在血淋巴中檢測(cè)到多角體。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，靈菌紅素可作用于DNA或DN

20、A拓?fù)洚悩?gòu)酶。本研究發(fā)現(xiàn)靈菌紅素主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，因而無(wú)法與DNA或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶發(fā)生直接作用。隨后，我們進(jìn)一步探討了靈菌紅素可能的作用靶標(biāo)。分析發(fā)現(xiàn)caspase3抑制劑Ac-DEVD-CHO對(duì)感染細(xì)胞無(wú)影響，而caspase廣譜性抑制劑Z-VAD-FMK可顯著抑制多角體形成，暗示BmNPV增殖可能依賴上游caspase的活化。由于caspase可參與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，而報(bào)道顯示NF-κB是靈菌紅素的作用靶標(biāo)之一，試驗(yàn)采用N