藺草再生與轉(zhuǎn)化體系的建立及其離體誘變種質(zhì)的創(chuàng)新.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩96頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

1、藺草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,但是到目前為止還沒有關(guān)于該植物種子誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷擴(kuò)繁及其植株再生方面的報道。鑒于藺草植物的重要性,通過轉(zhuǎn)基因和離體誘交獲得遺傳變異和品質(zhì)改良的藺革新種質(zhì)資源。進(jìn)行這些研究的第一步就是要建立一個高效的組織培養(yǎng)體系。 我們主要研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑的組合以及培養(yǎng)基更新對5種藺草品種植株再生的影響。在MS培養(yǎng)基中添加6-卞基腺嘌呤(BA)和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)對愈傷擴(kuò)繁、植株再生和植株擴(kuò)繁具

2、有明顯的促進(jìn)作用。在鄞藺1號、農(nóng)林4號、崗山、太草和臺灣綠草中,添加0.5mgL-1BA后,最高的愈傷誘導(dǎo)率分別達(dá)到80.95、90.48、75.40、70.83和83.33%。不同激素組合和連續(xù)接種(培養(yǎng)基更新)對胚性愈傷誘導(dǎo)和植株再生至關(guān)重要。實驗結(jié)果表明MS培養(yǎng)基中添加0.1mgL-1BA和2mgl-12,4-D對所有品種的藺草愈傷擴(kuò)繁最好。植株再生需要分兩步,主要是進(jìn)行培養(yǎng)基的更新和激素的平衡。通過把胚性愈傷組織從再生培養(yǎng)基I[

3、MS+0.5mgL-1BA+1.0mgL-1KT]轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基II[MS+0.5mgL-1BA+1.0mgL-1KT+3.0mgL-1IAA]后得到超過70%以上的再生植株。研究結(jié)果證實了生長素(IAA)與細(xì)胞分裂素(BA和KT)比例的重要性。在植株擴(kuò)繁實驗中,1/2MS培養(yǎng)基中添加0.5mgL-1BA后,農(nóng)林4號和太草分別得到最高的植株存活率和擴(kuò)增倍數(shù)(90.97%和5.40,94.23%和8.25)。建立的高效藺草植株再生體系可

4、進(jìn)一步進(jìn)行藺草的遺傳轉(zhuǎn)化和離體誘變等研究。 基于建立的高效藺草植株再生體系,進(jìn)一步研究建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)藺草的高效轉(zhuǎn)化體系。農(nóng)桿菌菌株EHA105內(nèi)含有pKUB質(zhì)粒帶有cryIA(b),hph和gus基因,后兩者為篩選標(biāo)記基因,分別編碼潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和β-葡萄糖苷酸酶基因。研究結(jié)果表明150μM的乙酰丁香酮在誘導(dǎo)和共培養(yǎng)實驗中均顯著地增加愈傷的GUS+率,當(dāng)菌液濃度OD600達(dá)到0.4時使愈傷GUS+顯著提高。侵染時間為45-

5、60分鐘,共培養(yǎng)時間為4天,侵染時間為第12或16天,這樣的組合對遺傳轉(zhuǎn)化最有利,達(dá)到最高效率有9.56%。周GUS瞬間表達(dá)和潮霉素抗性來篩選陽性轉(zhuǎn)化體,這一轉(zhuǎn)化體系可以用來通過轉(zhuǎn)基因的方法得到目標(biāo)性狀的植株,即通過種子得到胚性愈傷,在愈傷階段通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)等方法將目的基因轉(zhuǎn)入,然后得到轉(zhuǎn)基因的再生植株。通過這一再生體系再經(jīng)過轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化,初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)Bt基因的遺傳轉(zhuǎn)化體系。 基于藺草生態(tài)和經(jīng)濟(jì)上的重要性,對主栽品種

6、鄞藺1號進(jìn)行離體誘變處理,來研究甲基磺酸乙酯(EMS,0.1-1,0%處理6、12和24小時)和紫外線-C(UV-C,處理15、30、45和60分鐘)對藺草生理特征和超微結(jié)構(gòu)的影響。將藺草植株莖桿基部切取做離體誘變實驗,經(jīng)過EMS和UV-C處理后,將基段首先轉(zhuǎn)移到1/2MS培養(yǎng)基中,再轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土和珍珠巖混合的盆缽中生長和繁殖。植株的生長勢和生物量隨著誘交劑濃度的升高而顯著降低;在低誘變劑濃度時增加處理時間抗氧化酶活性明顯增加,但是,在

7、高處理濃度時,酶活性呈現(xiàn)下降的趨勢。生理和超微結(jié)構(gòu)在突變體莖桿中也發(fā)生了明顯變化,尤其是葉綠素含量明顯降低。突變體的細(xì)胞和葉綠體大小均有所降低,而且在葉綠體中出現(xiàn)了大量的脂滴,類囊體膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的瓦解。EMS和UV-C處理后得到的在形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)上有所改變的突變體為該作物創(chuàng)造了遺傳多樣性,一些具有形態(tài)和生理上新穎性狀的突變體被篩選用于植物育種中,并可進(jìn)一步用于遺傳研究。 對當(dāng)?shù)刂饕奶A草栽培品種農(nóng)林4號用抗有絲分裂的秋水仙堿

8、離體誘變處理,得到四倍體植株。植株莖桿基部在離體條件下用秋水仙堿(0、50、100和500mgL-1)分別處理6、12和24小時,然后將其轉(zhuǎn)移到1/2MS培養(yǎng)基中,再轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土和珍珠巖混合的盆缽中生長和繁殖。再生植株用流式細(xì)胞儀確定其倍性。四倍體植株在形態(tài)上比二倍體粗壯,生物量也多。進(jìn)一步研究秋水仙堿對植物細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上的作用,根據(jù)解剖和超微結(jié)構(gòu)的分析可以看出四倍體植株在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上與對照間的差異。從葉片表皮細(xì)胞可以看出四倍

9、體氣孔明顯加大,但是氣孔密度顯著降低。而且,四倍體葉肉細(xì)胞更加緊湊,細(xì)胞間隙小,但是維管束尺寸明顯加大。有趣的是,四倍體葉綠素含量明顯降低,這可能是類囊體降解的結(jié)果。從亞細(xì)胞的超微圖研究可以看出,高濃度的秋水仙堿對葉綠體有破壞作用,導(dǎo)致類囊體膜系統(tǒng)瓦解。這些藺草四倍體植株可以用來進(jìn)一步的遺傳研究。 目前研究中,由EMS和UV-C誘變后藺草DNA的損傷情況可以通過單細(xì)胞凝膠電泳的方法來進(jìn)行評價(SCGE)。SCGE也叫作彗星檢測,

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論