甘藍型油菜S45AB隱性細胞核雄性不育表達譜的研究.pdf

1、甘藍型油菜細胞核雄性不育(GMS)敗育徹底,不育性表現(xiàn)穩(wěn)定,細胞質來源豐富,恢復源廣泛,己成為我國油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑之一。甘藍型油菜近等基因系(NIL)S45AB只在育性控制位點上Bnms1/BnMs1存在差異。以S45AB作為基礎材料,利用半薄切片技術比較了S45AB花藥的顯微結構,利用差減文庫和基因芯片技術分析了S45AB花蕾轉錄譜的表達差異,并通過差異表達基因的功能分析,推理了可能導致S45A花粉敗育的代謝過程。主要結果如

2、下:
　　 半薄切片觀察發(fā)現(xiàn):在減數(shù)分裂前,不育材料S45A與可育材料S45B花藥沒有明顯差異；至四分體時期,不育花藥的絨氈層比可育花藥的體積增大并排列緊密；在單核花粉期,S45A中小孢子沒有花粉外壁的形成,小孢子切片呈光滑的圓形,發(fā)育長時間停留在小孢子單核期,同時,S45A中絨氈層繼續(xù)惡化,液泡化明顯,并最終解體。而在S45B中,由于小孢子表面外壁的存在,小孢子切片呈現(xiàn)出不規(guī)則四邊形,小孢子發(fā)育為成熟的花粉粒。S45A敗育發(fā)生

3、的開始時期為四分體至小孢子單核期,絨氈層異常是引起敗育的主要因為。
　　 利用SSH構建了正向差減文庫(富集了可育材料中上調表達的基因)和反向差減文庫(富集了不育材料中上調表達的基因)兩個文庫,每個文庫包含1536個克隆。對兩個文庫進行了反向Northern blot篩選,并且對正向文庫的陽性克隆進行了測序,發(fā)現(xiàn)這些克隆代表了71個基因,其中有4條基因,分別為At1g30330,At1g71170,At5g10400,At5g5

4、2160在擬南芥花蕾中特異或相對大量表達。
　　 利用Affymatrix公司的擬南芥寡核苷酸芯片,對S45AB花蕾之間的表達差異進行了分析,發(fā)現(xiàn)在S45B中有69條上調表達的基因,在S45A中有46條上調表達的基因。根據(jù)MIPS A.thaliana Genome Database提供的信息對這些基因,包括差減文庫獲得的和芯片篩選得的所有在S45B中上調表達的基因進行了功能歸類。結果表明,這些基因可分為18大類,包括參與代謝、

5、蛋白命運決定、蛋白結合功能、細胞轉運、環(huán)境互作、亞細胞定位的相關基因和未知功能基因,分別占了28.60％、12.20％、36.80％、11.40％、13.10％、41.80％和17.20％,參與代謝調節(jié)的基因很少,只占1.63％。對25個在S45B上調表達的基因和5個在S45A中上調表達的基因進行了Real-timePCR驗證,Real-time PCR結果證實芯片的結果真實可靠,并根據(jù)他們表達模式的差異,將在S45B中上調表達的23個

6、基因分成三類,對第一類基因做了功能分析,發(fā)現(xiàn)4個基因,At3g06860、At3g51590、At4g00040和At5g48880參與了脂肪酸代謝途徑,并且推測可能是絨氈層中脂肪酸代謝紊亂致使孢粉素合成受阻從而導致了S45A的小孢子敗育。
　　 根據(jù)Real-time PCR結果,比較了擬南芥花藥發(fā)育的關鍵基因,A6、CALS5、DEX1、MYB103、MS1、MS2和NEF1在S45AB花蕾中的表達模式,比較了各擬南芥突變體