油菜顯性細(xì)胞核雄性不育的分子機(jī)理研究.pdf

1、植物雄性不育是一種非常普遍的現(xiàn)象，它在植物育種中有非常重要的利用價值。油菜是我國及世界重要的油料作物之一，油菜雜種優(yōu)勢顯著，細(xì)胞核雄性不育是油菜雜種優(yōu)勢利用的重要途徑之一。目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)了多種類型的細(xì)胞核雄性不育材料，并在理論和應(yīng)用研究方面取得了巨大進(jìn)展。李樹林等(1985)等研究揭示了顯性核不育油菜的遺傳規(guī)律，建立了以純合兩型系、臨保系和恢復(fù)系三系配套制種模式，在油菜雜優(yōu)利用中顯示出巨大的應(yīng)用潛力，從而引起了國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。目

2、前，該種類型的甘藍(lán)型油菜核不育材料有4例報道。其中，“Shaan-GMS”是作者1994年發(fā)現(xiàn)的一種甘藍(lán)型油菜雄性不育材料，其不育性徹底、穩(wěn)定。經(jīng)典遺傳學(xué)研究表明，“Shaan-GMS”育性恢復(fù)性的遺傳機(jī)制符合2對核基因互作控制假說；其恢保關(guān)系與李樹林等的6CA相同。 基因芯片技術(shù)是90年代中期以來影響最深遠(yuǎn)的重大科技進(jìn)展之一。它一次可以對成千上萬個基因同時進(jìn)行檢測分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)復(fù)雜、自動化程度低、檢測目的

3、分子數(shù)量少、低通量等不足。自Schenaetal(1995)率先采用該技術(shù)成功檢測到48個擬南芥基因在根、莖組織中的差異表達(dá)后，它在植物科學(xué)研究中已開始廣泛應(yīng)用。應(yīng)用基因芯片技術(shù)大大加速了新基因的發(fā)現(xiàn)速度，現(xiàn)已檢測出一大批新基因和重新認(rèn)識到某些原有基因的新功能，并發(fā)現(xiàn)了與植物生理功能有關(guān)的順式作用元件，從而使人們對生命現(xiàn)象調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識更加深入。擬南芥和油菜同屬十字花科，兩者基因組間有很高的同源性，表達(dá)序列的同源性高達(dá)85％，且大多數(shù)擬

4、南芥中的基因在油菜中具有相同或相似的功能。Girkeetal(2000)率先將擬南芥cDNA芯片嘗試性地應(yīng)用于油菜種子發(fā)育中相關(guān)基因的表達(dá)研究并獲得了較為理想地效果，從實踐上證明了擬南芥cDNA芯片應(yīng)用于近緣植物研究的可能性。目前，將擬南芥cDNA芯片用于油菜等近緣植物的研究僅有幾例報道，Carlssonetal(2007)利用擬南芥花特異cDNA芯片比較分析了具擬南芥細(xì)胞質(zhì)的油菜雄性不育系和保持系的花中核基因的差異表達(dá)，結(jié)果表明，細(xì)胞

5、質(zhì)雄性不育系中線粒體基因組對細(xì)胞核基因的表達(dá)影響顯著，說明線粒體和細(xì)胞核間逆向信號的重要性。 本研究以甘藍(lán)型油菜Shaan-GMS的雜合兩型系220AB和純合兩型系803AB為試材：i)利用涂片法和石蠟切片法對其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂和小孢子的發(fā)育過程進(jìn)行觀察，以明確小孢子敗育時期及特點；ii)揭示與擬南芥MS2同源的油菜MS2Bnap基因的結(jié)構(gòu)特征，探討220A核不育與MS2Bnap基因的關(guān)系，為油菜與擬南芥同源基因的進(jìn)化提供一些

6、啟示。iii)利用基因芯片技術(shù)分析油菜顯性不育基因Ms和恢復(fù)基因Rf的表達(dá)譜，揭示顯性核不育及其恢復(fù)的分子機(jī)制。 現(xiàn)將主要結(jié)論摘要如下： 涂片法觀察結(jié)果表明，在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂前，Shaan-GMS不育株花藥發(fā)育與正?？捎晗啾葲]有明顯的結(jié)構(gòu)異?，F(xiàn)象；減數(shù)分裂期，部分花粉母細(xì)胞的染色體可能復(fù)制，但細(xì)胞并不分裂，不能形成四分體：可觀察到胼胝質(zhì)壁的形成，染色體聚集，染色很深；花粉粒不能形成外壁，小孢子細(xì)胞核開始降解，細(xì)胞質(zhì)

7、隨之開始降解，最后小孢子徹底降解。石蠟切片法觀察結(jié)果也表明，在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂前，Shaan-GMS不育株和可育株相比沒有明顯的結(jié)構(gòu)異常，能夠分化出四個藥室，其橫切面也呈蝴蝶狀結(jié)構(gòu)：不育株藥室中的小孢子數(shù)目明顯比正常可育株中少；從2.0mm花蕾開始，藥室中部分小孢子開始降解，到4mm花蕾，大部分花粉粒已降解，只有少數(shù)幾個花粉能染色。在整個花藥發(fā)育過程中，不育與正常油菜的絨氈層發(fā)育沒有觀察到差異。Shaan-GMS雄性敗育于花粉母細(xì)胞階

8、段，其主要特點是花粉母細(xì)胞不進(jìn)行減數(shù)分裂或減數(shù)分裂不正常，不能形成二分體或四分體，原生質(zhì)體濃厚并收縮，并逐步解體。 以PCR法從2個油菜雙顯性核不育系中克隆了4個與已報道的MS2Bnap基因相關(guān)的DNA片段：220B-gDNA(AY257490)、220A-gDNA(AY288778)、6C-gDNA(DQ060319)、6A-gDNA(DQ060318)。MS2Bnap基因全長為2581bp，含有總長為654bp的6個內(nèi)含子；

9、上述4個片段間共存在41個SNP，其中7個SNP位于外顯子區(qū)；220A-gDNA與220B-gDNA編碼的蛋白存在1個氨基酸差異，該差異可能與220A不育有關(guān)。220A-DNA與6A-DNA編碼的蛋白質(zhì)也存在1個氨基酸差異。擬南芥MS2基因含有總長為770bp的8個內(nèi)含子，油菜MS2Bnap基因和擬南芥MS2基因外顯子的同源性明顯高于內(nèi)含子的同源性。 用擬南芥ATH1GenomeArray研究了純合兩型系803AB(MsMsms

10、rfrf*MsMsRfrf)恢復(fù)基因Rf的表達(dá)譜。根據(jù)細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果，將雄性不育和可育花蕾按大小分3級。1級(S)：＜1mm；2級(M)：1mm-3mm；3級(L)：＞3mm。芯片實驗結(jié)果表明：不同變化標(biāo)準(zhǔn)檢測出的差異基因數(shù)目不同，以1.5X標(biāo)準(zhǔn)檢測的基因數(shù)目最多，以2X標(biāo)準(zhǔn)檢測的基因數(shù)目居中，以3X標(biāo)準(zhǔn)檢測的基因最少。在花蕾不同發(fā)育時期，檢測出的差異基因數(shù)目也不同。不論使用那種檢測標(biāo)準(zhǔn)，大蕾期檢測出的差異基因最多；中蕾次之；小蕾稍少。