水稻KCC基因的功能研究及鹽芥小RNA的功能研究.pdf

1、鹽脅迫是自然界中主要的非生物脅迫之一。陽離子運(yùn)輸體及植物體內(nèi)陽離子的均衡對植物耐逆及生長發(fā)育具有非常重要的作用。因?yàn)镵+和Na+對植物耐逆和營養(yǎng)方面具有非常重要的作用，所以K+和Na+運(yùn)輸體最近研究的比較廣泛和深入?，F(xiàn)在已經(jīng)非常清楚，植物在鹽脅迫條件下的適應(yīng)能力與C1-的均衡具有非常重要的關(guān)系，這不僅是因過多的C1-積累在植物共質(zhì)體能對植物產(chǎn)生毒害作用，更重要的是因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)的鹽性土壤中，C1-是最重要的陰離子。C1-能夠改變K+和Na

2、+的活性及其在植物組織和細(xì)胞間的分配。C1-和K+一樣，是高等植物內(nèi)的一種非常重要的營養(yǎng)元素和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物的滲透調(diào)節(jié)和細(xì)胞伸長方面具有非常重要的作用。在動物中，陽離子氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體(CCC)家族在控制動物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)及K+、Na+和C1-的均衡方面起著非常重要的作用。最近，在雙子葉植物擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtCCC基因在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及離子均衡方面具有非常重要的作用。到目前為止，在單子葉植物中還沒有關(guān)于陽離子氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)

3、體參與植物營養(yǎng)及鹽脅迫的分子方面的報道。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是利用單子葉植物水稻為研究材料，對其陽離子氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsKCC進(jìn)行研究，揭示其與水稻生長發(fā)育及耐鹽性的關(guān)系。 在世界范圍內(nèi)，非生物脅迫是引起農(nóng)作物減產(chǎn)的最主要的原因?？茖W(xué)家們做了大量的工作來揭示植物復(fù)雜的脅迫響應(yīng)機(jī)制，所做的工作主要集中在尋找和鑒定脅迫響應(yīng)蛋白上。最近研究發(fā)現(xiàn)，除了蛋白之外，microRNAs(miRNAs)和small interfering RNA

4、s(siRNAs)對植物脅迫響應(yīng)也具有非常重要的作用。隨后的研究發(fā)現(xiàn)小RNA對生物脅迫也具有很重要的作用。MiRNA和siRNA是一類小分子的非編碼的RNA，能夠介導(dǎo)mRNA的降解、抑制蛋白翻譯和對基因組進(jìn)行修飾。作為擬南芥近緣的鹽芥，是很有前景的植物耐鹽模式植物。本實(shí)驗(yàn)的主要目的是利用鹽芥為研究材料，克隆鹽芥的小RNA并研究其在鹽芥耐逆方面的功能，揭示其與鹽芥耐鹽性的關(guān)系。 本實(shí)驗(yàn)的主要結(jié)果如下： 1、水稻OsKCC基

5、因的克隆和功能分析 1)根據(jù)動物中的陽離子氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體的蛋白序列做blastp分析，發(fā)現(xiàn)在水稻中具有四個與其關(guān)系相近的陽離子氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體。選擇其中一個OsKCC基因設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR方法從水稻中克隆獲得OsKCC基因的全長序列。該基因的開放閱讀框全長為2970bp，共編碼989個氨基酸，分子量約為109 KD。 2)對該基因的序列特征做了詳細(xì)的分析，發(fā)現(xiàn)OsKCC基因與已報道的植物比如擬南芥AtCCC基因同源

6、性很高，與動物中的同源性較遠(yuǎn)，但它蛋白結(jié)構(gòu)與動物及人中的KCC蛋白最為相似。用跨膜區(qū)預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸序列具有11個跨膜的結(jié)構(gòu)域。 3)對OsKCC基因在水稻不同部位及不同脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行了詳細(xì)的分析。Real-timePCR結(jié)果表明水稻根中OsKCC基因的表達(dá)量要比地上部分高，且均受NaC1和KC1誘導(dǎo)，KC1誘導(dǎo)OsKCC基因上升的程度比NaC1高。 4)將OsKCC的開放讀碼框構(gòu)建到植物表達(dá)載體pR

7、OKⅡ中，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌AGL1后，轉(zhuǎn)化水稻。轉(zhuǎn)基因水稻在含G418(40mg/L)的MS培養(yǎng)基上連續(xù)篩選，獲得了32個純合的T3代轉(zhuǎn)OsKCC基因的植株。選用兩個純合的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行分子驗(yàn)證和生理分析。PCR和red-time PCR證實(shí)OsKCC基因己整合進(jìn)水稻基因組并正常的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。生理測試分析表明在正常條件和NaC1及KC1脅迫下，轉(zhuǎn)OsKCC基因的水稻植株與野生型植株差異不顯著。 5)構(gòu)建了水稻OsKCC的GFP定位載

8、體，轉(zhuǎn)化水稻和洋蔥表皮細(xì)胞。OsKCC蛋白在水稻及洋蔥表皮細(xì)胞中的定位分析表明，OsKCC蛋白定位在植物細(xì)胞的細(xì)胞膜上。 6)構(gòu)建了OsKCC基因的沉默載體pROKⅡ-KCC：Ri，轉(zhuǎn)化水稻。轉(zhuǎn)基因水稻在含G418(40mg/L)的MS培養(yǎng)基上連續(xù)篩選，獲得了18個純合的T3代OsKCC基因沉默的植株。Red-time PCR證實(shí)了基因沉默水稻中OsKCC基因的表達(dá)量明顯低于野生型對照。對基因沉默水稻的耐逆性分析表明OsKCC基

9、因沉默后增加了基因沉默水稻的KC1和NaC1的敏感性。KC1和NaC1脅迫下與野生型對照相比基因沉默水稻的地上部分和根中的K+和C1含量都降低，Na+含量沒有明顯的差異。 2、鹽芥小RNA的克隆及功能研究 1)構(gòu)建了一個300 mM NaC1處理24小時的鹽芥小RNA庫，通過測序分析發(fā)現(xiàn)這個庫內(nèi)有22個miRNA，它們屬于13個miRNA家族。 2)構(gòu)建了miR393、miR398和miR400的沉默表達(dá)載體，并

10、轉(zhuǎn)化了鹽芥。 3)克隆了ThSRO5和ThP5CDH基因間的DNA片段。分別克隆出了ThSRO5和ThP5CDH基因的3’非編碼區(qū)，并克隆到了polyA位置。在鹽芥中ThSR05和ThP5CDH基因的3’端不存在反向互補(bǔ)，就不能像擬南芥那樣產(chǎn)生可以降解P5CDH基因的SiRNA。 4)鹽芥中脯氨酸含量隨著NaC1濃度的增加和處理時間的延長而逐步增加，在ABA、PEG、脯氨酸和4℃處理后鹽芥體內(nèi)脯氨酸含量也顯著增加。Rea

11、l-time PCR數(shù)據(jù)顯示P5CS基因在各種脅迫處理后其表達(dá)量都上升，隨著NaC1濃度的增加．PSCS基因表達(dá)量也在增加。PSCDH基因在各種處理后表達(dá)量都上升，它的變化趨勢和體內(nèi)脯氨酸的變化趨勢是比較一致的。SRO5基因在各種處理后表達(dá)量也上升，其變化趨勢與P5CDH基因的變化趨勢一致。 本研究的主要創(chuàng)新點(diǎn)： 1、首次對單子葉植物水稻的OsKCC基因進(jìn)行較為詳盡的研究，證明OsKCC是一個有功能的定位于細(xì)胞膜K+-C

12、1共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠介導(dǎo)K+和C1向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。對OsKCC基因在不同脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行了的分析。OsKCC基因沉默后增加了轉(zhuǎn)基因水稻對NaC1和KC1的敏感性。基因沉默水稻在NaC1和KCl處理后體內(nèi)的K+和C1-含量下降。 2、首次構(gòu)建了鹽芥的小RNA庫，并克隆得到了22個miRNA。構(gòu)建了3個脅迫相關(guān)miRNA的沉默載體。 3、首次證明鹽芥和擬南芥的脯氨酸在脅迫條件下變化趨勢的不同是由siRNA的作用不同引起的。在