人乳頭瘤病毒18型基因工程預(yù)防性疫苗研究.pdf

1、宮頸癌和宮頸癌前病變是全世界婦女健康的一個(gè)主要問題。臨床學(xué)，分子生物學(xué)，和流行病學(xué)調(diào)查已經(jīng)證明人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是宮頸癌和宮頸非典型增生的主要病因<'[1]>。99％的宮頸癌患者被檢測(cè)含有高危型HPVs，最常見的類型有16，18，31，和45<'[1]>。每年，全世界約有470，000例宮頸癌患者被診斷出來，有一半的婦女將痛苦地死亡。在美國(guó)，每年要進(jìn)行5千萬例巴氏試驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)約有1.2百萬

2、例低度宮頸非典型增生(Cervical intraepithelial neoplasia [CIN]1)，300，000例高度宮頸非典型增生(CIN2/3)和10，000例宮頸癌<'[2]>。在美0國(guó)，每年用于宮頸癌的篩選和治療的醫(yī)療費(fèi)估計(jì)在60億美元。雖然在發(fā)達(dá)國(guó)家通過巴氏試驗(yàn)大幅度降低了這種疾病的發(fā)病率，在美國(guó)2005年仍然有3，710人死于宮頸癌。在世界其它地方，大多數(shù)婦女不能進(jìn)行常規(guī)婦科檢測(cè)和篩選，宮頸癌在女性腫瘤死亡率中居第

3、2位，繼乳腺癌之后。 現(xiàn)在治療宮頸非典型增生僅限于切除或燒蝕方法來移除或破壞宮頸組織。這樣治療的有效率大約達(dá)到90％，但可能復(fù)發(fā)和帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。外科治療只是切除宮頸非典型增生組織，那些似乎正常的感染HPV的組織而未處理<'[3]>。因此根除這種感染最理想的方法是用疫苗，就像乙肝預(yù)防乙型肝炎一樣，在青少年沒有遇到HPV之前就注射預(yù)防性疫苗。對(duì)于那些已經(jīng)感染的婦女和遭受早期宮頸癌的患者可以用正在研究中的治療性疫苗。Merck公司用

4、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)研制的HPV6,11，16，18型四價(jià)疫苗，商品名Gardasil(嘉德西哥)于2006年6月8日被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。葛蘭素史克(GSK)公司采用桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)研制的HPV16/18型兩價(jià)疫苗也已接近完成Ⅲ期臨床研究，可能在2007年10月獲得批準(zhǔn)上市。 本研究主要是從Genebank中查出所有的較全18L1基因序列，并按照畢赤酵母密碼子偏愛性原則，優(yōu)化設(shè)計(jì)出HPV18L1基因(1725bp)并合成全

5、長(zhǎng)序列，然后利用畢赤酵母表達(dá)載體pA0819<'r>表達(dá)載體，在體外構(gòu)建含一個(gè)和二個(gè)拷貝的L1基因載體pA0819r-L1和pA0819r-L1Ⅱ。線形化后轉(zhuǎn)化到Gs115酵母細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選獲高拷貝工程菌并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。構(gòu)建了DNA疫苗載體pDRVI1.0-18L1，大提質(zhì)粒后免疫BalB/C小鼠制備抗體，為研制HPV18型診斷試劑和抗原鑒定提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 表達(dá)產(chǎn)物采用化學(xué)發(fā)光Western blot鑒定，用自制

6、抗HPV18 L1蛋白鼠血清作為一抗，在55KDa處有誘導(dǎo)蛋白免疫印跡出現(xiàn)。證明該表達(dá)系統(tǒng)能表達(dá)出HPV18L1蛋白。細(xì)胞破碎后經(jīng)過超速梯度離心的純化方法，得到的樣品在電鏡下觀察到HPV18的病毒樣顆粒。篩選出畢赤酵母高表達(dá)株后，進(jìn)行了5L發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝，菌體破碎工藝和純化工藝摸索。實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建的畢赤酵母表達(dá)菌株，可經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)HPV18L1晚期蛋白，表達(dá)的L1能在細(xì)胞內(nèi)自主組裝成病毒樣顆粒，而且能在廉價(jià)的培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)到高細(xì)胞密度