表達(dá)雞傳染性貧血病毒凋亡素的重組新城疫病毒的構(gòu)建及其抗腫瘤特性研究.pdf

1、新城疫病毒(NDV)作為溶瘤病毒之一，其抗腫瘤作用早在50年代就有人提出。NDV可誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素、白細(xì)胞介素等細(xì)胞因子，也可以刺激淋巴細(xì)胞的分化和改變腫瘤細(xì)胞的免疫原性；同時(shí)NDV可以激活機(jī)體的免疫細(xì)胞，使免疫細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性功能從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。 凋亡素(Apoptin)是來(lái)源于雞傳染性貧血病毒(chicken anemia virus，CAV)的小分子蛋白質(zhì)。凋亡素具有誘導(dǎo)雞胸腺細(xì)胞、成淋巴樣細(xì)胞系、多種人惡性成淋巴樣細(xì)

2、胞系和人骨髓瘤細(xì)胞凋亡的特性，而對(duì)正常的細(xì)胞無(wú)凋亡作用。凋亡素的抗腫瘤機(jī)制不依賴(lài)于p53途徑，且不被抑凋亡蛋白bcl-2所阻遏。所以凋亡素作為一種潛在的抗腫瘤侯選藥物，在惡性腫瘤的治療中具有價(jià)值。 基于NDV和凋亡素的不同抗腫瘤機(jī)制，本研究利用反向遺傳技術(shù)，以NDVZJ1毒株為載體，構(gòu)建了表達(dá)CAV凋亡素的重組NDV，并且通過(guò)體內(nèi)及體外抗腫瘤性實(shí)驗(yàn)比較了重組病毒和ZJ1毒株的抗腫瘤特性，旨在研究和開(kāi)發(fā)一種抗腫瘤的新型疫苗。

3、 1、表達(dá)CAV凋亡素的重組NDV的構(gòu)建 用特異性引物擴(kuò)增CAV的凋亡素(VP3)基因，將純化的PCR產(chǎn)物克隆后得到質(zhì)粒T-VP3。再根據(jù)NDV ZJ1株基因序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，用于擴(kuò)增NDVP-M基因(2880-4709nt)之間的約1.8kb大小的片段，構(gòu)建了質(zhì)粒pUC/NDV。將VP3基因插入pUC/NDV，構(gòu)建了中間質(zhì)粒pUC/NDVVP3。pUC/NDVVP3經(jīng)酶切后，替換到含T7啟動(dòng)子的ZJ1株基因組cDNA克

4、隆(pNDV/ZJ1)的相應(yīng)部分，得到了含凋亡素基因的重組質(zhì)粒pNDV-VP3。 將質(zhì)粒pNDV-VP3與NP、P、L真核表達(dá)質(zhì)粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，拯救出含凋亡素基因的重組NDV。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明VP3基因已插入到NDV ZJ1株基因組當(dāng)中；Westem blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，重組病毒能成功表達(dá)凋亡素蛋白。 2、表達(dá)CAV凋亡素的重組NDV的抗腫瘤特性研究 采

5、用MTT法檢測(cè)了NDV ZJ1毒株和重組病毒所引起的肺癌細(xì)胞A549和肝癌細(xì)胞SMMC7721的死亡率，結(jié)果表明在相同的作用時(shí)間內(nèi)(48h)，隨著病毒感染量的增高，兩種病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性都有所提高；在病毒感染量相同的情況下，重組病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性要比ZJ1毒株強(qiáng)。 病毒的體內(nèi)抗腫瘤性試驗(yàn)在SMMC7721荷瘤BALB/c小鼠體內(nèi)完成。首先在小鼠的腹部皮下注射腫瘤細(xì)胞，當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)到一定體積時(shí)，在瘤內(nèi)注射ZJ1株病毒或重組病