表達(dá)人λ1干擾素的重組新城疫病毒的構(gòu)建以及其抗胃腺癌活性研究.pdf

1、目的：構(gòu)建表達(dá)人IFN-λ1蛋白的重組新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV) lasota病毒株，并命名為rL-IFN-λ1，感染至體外培養(yǎng)的胃腺癌細(xì)胞SGC7901，檢測其在SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)情況，并研究rL-IFN-λ1對胃癌細(xì)胞增殖及其細(xì)胞凋亡的影響，探索rL-IFN-λ1抗胃癌活性以及機(jī)制。
　　方法：利用RT-PCR克隆出IFN-λ1基因與pBluescripII Ks(+)載體連接

2、并進(jìn)行鑒定，選擇陽性的質(zhì)粒進(jìn)行IFN-λ1基因的擴(kuò)增，并與NDV感染性克隆載體pBRN-FL-PmeI連接，并進(jìn)行鑒定。選擇陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞進(jìn)行病毒拯救，并檢測病毒生長活性。
　　利用 Western、RT-PCR、和免疫熒光分析方法鑒定IFN-λ1在rL-hIFN-λ1感染的人源胃癌SGC-7901細(xì)胞系的表達(dá)。利用Western、PCR檢測了多個(gè)胃癌細(xì)胞系包括SGC-7901和AGS以及外周血單核粒細(xì)胞（PBMCs）等細(xì)

3、胞表面IFN-λ1特異性受體IFNLR1的表達(dá)情況。將重組的新城疫病毒感染至胃癌細(xì)胞株SGC7901，用MTT法分析重組病毒對癌細(xì)胞增殖的影響，用TUNAL、Western和流式細(xì)胞術(shù)檢測rL-IFN-λ1誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。用ELISA法檢測感染重組病毒rL-IFN-λ1以及病毒rL24h后檢測胃癌細(xì)胞上清中IFN-λ1蛋白濃度，收取重組病毒 rL-hIFN-λ1以及病毒 rL感染胃腺癌腫瘤細(xì)胞SGC790172h細(xì)胞上清液，分別其與P

4、BMCs共培養(yǎng)5天后，用ELISA法測Th1相關(guān)細(xì)胞因子干擾素γ（IFN-γ）和Th2相關(guān)細(xì)胞因子白介素-13（IL-13）的細(xì)胞因子水平，并設(shè)置多個(gè)對照組，PBS為空白對照組。
　　結(jié)果: pBRN-hIFN-λ1的酶切結(jié)果出現(xiàn)610bp條帶，測序顯示符合Genebank上報(bào)道的序列。磷酸鈣轉(zhuǎn)染后重組病毒拯救成功，電鏡觀察到重組病毒顆粒，將此病毒命名為rL-hIFN-λ1。rL-hIFN-λ1的生長特性相較于NDV沒有變化。在雞

5、胚傳代以及感染胃腺癌腫瘤細(xì)胞后插入的外源基因能夠穩(wěn)定表達(dá)。重組新城疫病毒rL-hIFN-λ1保留了NDV LaSota弱毒株高滴度的雞胚生長特性、對易感雛雞的低致病性及良好的免疫原性的特點(diǎn)。重組新城疫病毒rL-hIFN-λ1和 NDV LaSota株感染胃腺癌細(xì)胞SGC7901后，RT-PCR以及Western blot均顯示出IFN-λ1正確條帶;免疫熒光法顯示IFN-λ1和NDV蛋白在rL-hIFN-λ1感染組出現(xiàn)，NDV感染組有N

6、DV蛋白表達(dá)，PBS組沒有蛋白表達(dá)。感染rL-hIFN-λ124h后可在胃腺癌細(xì)胞上清中檢測到高濃度的IFN-λ1蛋白。MTT結(jié)果顯示相對于NDV感染的SGC7901細(xì)胞， rL-hIFN-λ1對胃腺癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)更明顯(p<0.05)。TUNAL檢測凋亡指數(shù)顯示rL-hIFN-λ1感染組相較于NDV感染組和PBS組數(shù)值明顯增高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Western結(jié)果顯示rL-hIFN-λ1感染組凋亡蛋白caspase

7、-3表達(dá)量較NDV感染組和PBS組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rL-IFN-λ1比NDV更能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的早期凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫學(xué)研究表明，rL-hIFN-λ1能夠增強(qiáng)癌細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)(誘導(dǎo)Th1細(xì)胞)而抑制IL-13（Th2）細(xì)胞的表達(dá)來改變癌癥微環(huán)境從而抑制癌癥細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建表達(dá)人干擾素λ1重組新城疫病毒rL-hIFN-λ1,rL-hIFN-λ1能夠