棉鈴蟲煙堿型乙酰膽堿受體α7亞基基因克隆及功能研究.pdf

1、棉鈴蟲Helicoverpa armigera(Hübner)是我國棉花、玉米、小麥、等多種作物及花卉、蔬菜的重要害蟲。Bt棉大面積推廣種植對棉鈴蟲有較好的防控作用，但同時(shí)也增加了選擇壓，抗性風(fēng)險(xiǎn)增加。由于棉花生長后期Bt殺蟲蛋白表達(dá)量下降，對三、四代棉鈴蟲控制作用降低，部分年份仍需噴灑化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治。盡管Bt棉廣泛種植減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用，使棉鈴蟲對化學(xué)殺蟲劑的抗性水平有所降低，但多年來抗性監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，棉鈴蟲對各種傳統(tǒng)殺蟲劑抗性仍

2、保留在一定水平。
　　乙基多殺菌素spinetoram是多殺菌素類殺蟲劑的第二代產(chǎn)品，其活性是多殺菌素的10倍，對棉鈴蟲有較好的防治作用;既有化學(xué)農(nóng)藥的速效性，又有生物農(nóng)藥的安全性，而且作用機(jī)理新穎，與傳統(tǒng)農(nóng)藥無交互抗性，對環(huán)境友好，低毒，無殘留，符合新農(nóng)藥的發(fā)展方向，其作用機(jī)理的研究將有利于新農(nóng)藥的開發(fā)利用。
　　前期對棉鈴蟲幼蟲經(jīng)乙基多殺菌素處理后差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，煙堿型乙酰膽堿受體(nAchRs，nico

3、tinic acetylcholine receptors)α7亞基mRNA表達(dá)量明顯上調(diào)。因此本文克隆了棉鈴蟲nAchRsα7亞基基因，分析其表達(dá)譜，并對其功能進(jìn)行了初步研究。利用簡并引物和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)成功獲得了棉鈴蟲nAchRsα7亞基序列，該序列全長3632bp（GenBank登錄號:KM884875），開放閱讀框1491bp，編碼496個(gè)氨基酸。具有半胱氨酸環(huán)受

4、體家族的共同特征:細(xì)胞外N端和C端，四個(gè)跨膜區(qū)TM1、TM2、TM3、TM4，和一個(gè)大的胞內(nèi)環(huán);其中N端有配體結(jié)合區(qū)，有間隔13個(gè)氨基酸連接的兩個(gè)半胱氨酸組成的半胱氨酸環(huán)，兩個(gè)緊密相連的半胱氨酸;配體結(jié)合區(qū)和跨膜區(qū)保守性很高，胞內(nèi)環(huán)變異性很大。與煙芽夜蛾的nAchRsα7-1核苷酸序列同源性99％，氨基酸序列同源性100％。通過構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)昆蟲的nAchRsα5、α6、α7亞基與脊椎動(dòng)物的α7亞基近緣。對昆蟲的α5、α6、α7亞基進(jìn)行

5、氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)環(huán)區(qū)域有12個(gè)連續(xù)的氨基酸(RSSKSLLANVLD)完全相同，這是其它亞基沒有的。表明昆蟲的α5、α6、α7亞基可能具有某種類似的功能。
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）對棉鈴蟲nAchRsα7亞基mRNA在整個(gè)發(fā)育期、各組織間以及經(jīng)乙基多殺菌素處理后的表達(dá)量進(jìn)行了測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn):α7亞基mRNA在成蟲表達(dá)量顯著高于卵期，是卵期表達(dá)量的7.04倍;幼蟲各齡期表達(dá)量較低，且無顯著差異;幼蟲頭部表

6、達(dá)量顯著高于胸、腹部，是胸、腹部的5.42-6.04倍。經(jīng)乙基多殺菌素LC60劑量處理72 h后nAchRsα7亞基表達(dá)量顯著升高，是對照組的2.01倍。推測棉鈴蟲nAchRsα7亞基可能在乙基多殺菌素毒殺棉鈴蟲的過程中發(fā)揮一定的作用。
　　利用兩種siRNA(siRNA001，siRNA002)通過顯微注射技術(shù)對棉鈴蟲3齡幼蟲nAchRsα7亞基進(jìn)行RNA干擾，通過qRT-PCR進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，72 h干擾效率分別為73.56％，

7、66.39％，表明siRNA001干擾效果較好;siRNA001注射后對棉鈴蟲整個(gè)幼蟲階段體重變化沒有顯著影響;RNA干擾后，棉鈴蟲對乙基多殺菌素的敏感度升高，48 h死亡率和體重抑制率分別為36.11％，59.47％低于對照組52.78％，84.65％;72 h死亡率和體重抑制率分別為52.78％，65.24％低于對照組72.22％，90.18％％。表明棉鈴蟲nAchRsα7亞基是乙基多殺菌素潛在的作用靶標(biāo)或是靶標(biāo)受體的組成亞基。

8、r>　　本文還對棉鈴蟲nAchRsα7亞基的體外表達(dá)進(jìn)行了初步探索，將nAchRsα7亞基(cRNA)單獨(dú)或是與鼠nAchRsβ2亞基共同以1∶1的比例顯微注射27.6 ng到爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)，用乙酰膽堿刺激，通過雙電極電壓鉗系統(tǒng)檢測，發(fā)現(xiàn)都能檢測到明顯的電流變化，但是對同一個(gè)細(xì)胞用不同劑量刺激未能檢測到連續(xù)的電流變化。
　　以上結(jié)果表明，棉鈴蟲nAchRsα7亞基在乙基多殺菌素毒殺棉鈴蟲的過程中可能發(fā)揮一定的作用。通過構(gòu)建爪蟾卵母