紅松體細(xì)胞胚胎發(fā)生及超低溫保存技術(shù)研究.pdf

1、本研究以紅松(Pinus koraiensis sieb. Et zucc.)未成熟合子胚為外植體，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，研究了紅松體細(xì)胞胚胎發(fā)生的各種影響因素、胚性愈傷組織在體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)過(guò)程中的生理生化特性以及愈傷組織的超低溫保存，具體結(jié)果如下： 1、分別于7月5日、7月15日、7月25日采收紅松未成熟合子胚，在添加2,4-D 1.0、2.0、4.0mg/L，6-BA 0.5、1.0、2.0mg/L GLH 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈

2、傷組織。結(jié)果表明：未成熟合子胚的采樣時(shí)間(發(fā)育程度)、2,4-D和6-BA的濃度極顯著影響紅松愈傷組織的誘導(dǎo)率。多重比較可知7月5日前后為紅松未成熟合子胚的最佳采樣時(shí)期，2,4-D 2.0mg/L＋6-BA1.0mg/L為誘導(dǎo)紅松愈傷組織的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合，最高誘導(dǎo)率達(dá)43.33％。 2、紅松胚性愈傷組織增殖階段的生長(zhǎng)曲線基本呈“S”形，繼代20d后胚性愈傷組織增長(zhǎng)趨于停滯。胚性愈傷組織生長(zhǎng)率先快后慢，生長(zhǎng)率最大值出現(xiàn)在繼

3、代后第12d 左右。研究結(jié)果表明了紅松胚性愈傷組織增殖培養(yǎng)階段適宜的繼代頻率為每2-3周繼代一次。 3、分別在GLH 培養(yǎng)基上添加不同濃度的蔗糖、ABA、PEG 來(lái)誘導(dǎo)紅松體細(xì)胞胚，結(jié)果表明不同濃度的蔗糖、ABA 對(duì)紅松體細(xì)胞胚胎的誘導(dǎo)有極顯著影響，GLH＋蔗糖60g/L＋ABA 20mg/L為誘導(dǎo)紅松體細(xì)胞胚胎的最佳培養(yǎng)基，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)數(shù)量達(dá)到47.5個(gè)/克愈傷組織，但PEG對(duì)紅松體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)并沒(méi)有顯著影響。誘導(dǎo)所得體細(xì)胞胚

4、在萌發(fā)培養(yǎng)基(GLH＋蔗糖20g/L)上萌發(fā)率為73.3％。萌發(fā)后生成的體胚苗移栽成活率為64.3％。 4、成熟胚誘導(dǎo)階段紅松胚性愈傷組織內(nèi)可溶性總糖與蔗糖含量變化趨勢(shì)相似，兩者都是0-5d 迅速上升，5-15d下降，15-25d再上升，之后保持平穩(wěn)。可溶性蛋白質(zhì)含量在0-10d升高，10-20d降低，20d后又上升并有分子量大小約為63.2和31.7KD兩種特異蛋白出現(xiàn)，這些特異蛋白可能作為體細(xì)胞胚胎形成的調(diào)控因子或結(jié)構(gòu)蛋白而

5、起作用。糖分與蛋白含量在此階段均出現(xiàn)先上升、后下降再上升的變化趨勢(shì)，這這表明此階段胚性愈傷組織內(nèi)代謝旺盛，體細(xì)胞胚胎正在形成。 5、紅松愈傷組織分別預(yù)處理0、12、24、36、48h后用6種不同的冷凍保護(hù)劑進(jìn)行超低溫保存，保存3d后用4種不同方法解凍，結(jié)果表明：利用0.4mol/L 山梨醇(Sorb)溶液將紅松愈傷組織預(yù)處理24h，以5％DMSO＋Sorb 0.4mol/L為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行超低溫保存，采用20℃流水沖洗解凍，細(xì)胞