擬南芥幼苗的超低溫保存及其遺傳變異研究.pdf

1、本研究以模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)為材料，對其幼苗的玻璃化法超低溫保存條件進行了進一步優(yōu)化，并通過形態(tài)觀察和分子標記技術(shù)對超低溫保存處理前后材料的遺傳穩(wěn)定性進行了比較研究。主要研究結(jié)果如下： 1.進一步優(yōu)化了擬南芥幼苗玻璃化法超低溫保存的程序，成活率可達92﹪以上。萌發(fā)1～2 d的幼苗室溫下預處理(2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖)20 min，然后，換成玻璃化保護液PVS2(30﹪甘油

2、+15﹪DMSO+15﹪乙二醇+0.4mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基)于冰水混合物中處理50～60 min，立即投進液氮中保存，恢復時，先在40℃水浴中迅速化凍(不斷搖晃)，接著用洗滌液(含1.2 mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基)洗滌20～30 min，每10 min換一次洗滌液，最后轉(zhuǎn)接到新的MS培養(yǎng)基上置入溫室培養(yǎng)。5 d后統(tǒng)計成活率，10 d后移栽到培養(yǎng)土(蛭石：營養(yǎng)土=1：1)中培養(yǎng)，60 d后收獲種子。 2.對超低溫保存處

3、理的苗和對照的生長發(fā)育進行形態(tài)觀察比較。所有處理過的苗(包括在液氮中冷凍過的和未冷凍的)在恢復處理兩天內(nèi)生長都很緩慢，而對照組幼苗則生長很快。經(jīng)過超低溫保存處理但未經(jīng)受液氮冷凍和化凍的幼苗幾乎全部成活(達98﹪)，而那些經(jīng)過完整超低溫保存處理的幼苗，化凍恢復后成活率下降到93.8﹪。前20 d，對照組的苗與兩個處理組的苗相比生長較快，隨后差異減小，至抽薹期三組樣品的植株形態(tài)大小基本一致，均正常開花、結(jié)實。 3.應(yīng)用擴增片段長度多

4、態(tài)性(AFLP)技術(shù)對處理過的及對照組的幼苗基因組DNA進行分析。EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ對基因組DNA進行雙酶切，用7對引物組合共擴增出549條帶，在3組樣品間未發(fā)現(xiàn)有差異片段出現(xiàn)。表明在超低溫保存處理過程中沒有造成保存材料基因組DNA序列的變化。 4.運用甲基敏感擴增多態(tài)性(MSAP)標記分析了處理樣品與對照組樣品間及其第二代的甲基化水平情況。Msp Ⅰ和Hap Ⅱ分別與EcoR Ⅰ結(jié)合對基因組DNA進行雙酶切，在擴增的66