龍眼、荔枝胚性培養(yǎng)物超低溫保存研究.pdf

1、龍眼、荔枝同屬無患子科，是南方重要熱帶亞熱帶特產(chǎn)果樹。本研究以龍眼、荔枝胚性培養(yǎng)物為材料，進行龍眼、荔枝玻璃化超低溫保存方法研究；同時，以龍眼胚性培養(yǎng)物為材料，進行超低溫保存過程中低溫預(yù)培養(yǎng)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以進一步探索超低溫保存機理。主要研究結(jié)果如下： 1．龍眼、荔枝胚性培養(yǎng)物的玻璃化超低溫保存技術(shù)體系 以龍眼胚性培養(yǎng)物為供試材料，探討繼代培養(yǎng)時間、化凍方式、不同發(fā)育階段低溫預(yù)培養(yǎng)對龍眼胚性培養(yǎng)物玻璃化超低溫保存的影響

2、。試驗結(jié)果表明，繼代培養(yǎng)12～15 d的龍眼胚性愈傷組織用于玻璃化超低溫保存，可獲得較高的細胞活力；40℃溫水浴、25℃左右室溫和自來水沖洗3種不同的化凍方式對龍眼胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存后的存活率影響差異不大；球形胚玻璃化超低溫保存后的細胞活力，比正常的胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存后的細胞活力高。 以荔枝胚性愈傷組織為供試材料，探討低溫預(yù)培養(yǎng)、化凍方式以及光照條件對荔枝胚性愈傷組織玻璃化超低溫保存的影響。結(jié)果表明荔枝胚性愈

3、傷組織5℃低溫預(yù)培養(yǎng)2 d再進行超低溫保存，采用40℃溫水浴化凍和自來水流水沖洗化凍都能明顯提高保存后的細胞活力；超低溫保存后的培養(yǎng)物置于黑暗中進行為期15 d的恢復(fù)生長，然后轉(zhuǎn)到正常光照條件下進行培養(yǎng)，能使超低溫保存后的荔枝愈傷組織較快地恢復(fù)生長，細胞存活率較高。 2．龍眼、荔枝胚性愈傷組織 玻璃化超低溫保存后的體胚發(fā)生與植株再生龍眼、荔枝胚性愈傷組織經(jīng)玻璃化超低溫保存后均能進行正常的體細胞胚胎發(fā)生，與超低溫保存前正常

4、的胚性愈傷組織體胚發(fā)生數(shù)量接近，并且體胚能完成正常分化，形成形態(tài)正常、粗壯的完整再生植株，表明龍眼、荔枝胚性愈傷組織經(jīng)玻璃化超低溫保存后，在體胚發(fā)生與再生植株能力方面沒有產(chǎn)生明顯變化。 3．龍眼、荔枝胚性愈傷組織 玻璃化超低溫保存后遺傳穩(wěn)定性的檢測利用RAPD技術(shù)從DNA分子水平對玻璃化超低溫保存的龍眼、荔枝胚性愈傷組織進行遺傳穩(wěn)定性檢測。篩選了10條隨機引物，對玻璃化超低溫保存前和保存后的胚性愈傷組織基因組DNA進行擴

5、增。檢測結(jié)果表明，超低溫保存的體細胞無性系遺傳穩(wěn)定性基本得到保持，但也發(fā)現(xiàn)存在小量的變異現(xiàn)象，有個別引物擴增的譜帶，在超低溫保存前和超低溫保存后存在一些差異。其中，龍眼胚性愈傷組織超低溫保存后的變異率為3.0～3.5％，荔枝胚性愈傷組織超低溫保存后的變異率為7.48％。玻璃化超低溫保存后產(chǎn)生的遺傳變異與超低溫保存過程中環(huán)境脅迫有關(guān)。 4．低溫預(yù)培養(yǎng)對龍眼球形胚存活力和蛋白質(zhì)表達的影響 玻璃化超低溫保存前的低溫預(yù)培養(yǎng)對保存

6、后球形胚活力與蛋白質(zhì)的表達有直接的關(guān)系。在5℃預(yù)培養(yǎng)4 d時，超低溫保存后的球形胚活力最高，達82.58％，此時蛋白質(zhì)表達情況為新誘導(dǎo)4個蛋白點，上調(diào)表達1個蛋白點，新誘導(dǎo)與上調(diào)表達的蛋白點數(shù)最多，共5個蛋白點；在低溫預(yù)培養(yǎng)6 d時，超低溫保存后的球形胚活力反而下降，為70.25％，此時蛋白質(zhì)表達情況為消失4個蛋白點，下調(diào)表達153個蛋白點數(shù)，消失與下調(diào)表達的蛋白點數(shù)達157個。新誘導(dǎo)和上調(diào)表達的蛋白增強了細胞的抗凍能力，使超低溫保存后

7、的存活率提高。消失和下調(diào)表達的蛋白導(dǎo)致細胞的抗凍能力減弱，由此引起超低溫保存后的存活率下降。表明龍眼體胚超低溫保存前的低溫預(yù)培養(yǎng)以5℃、4 d為最佳。 5．低溫預(yù)培養(yǎng)特異表達蛋白的生物質(zhì)譜鑒定與功能分析 對龍眼LC<,2>球形胚5℃低溫預(yù)培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的特異表達蛋白LLT1、LLT<,2>、LLT3和LLT4，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進行肽質(zhì)量指紋分析，匹配分析結(jié)果表明：LLT3