幾丁質酶抑制活性蛋白酶基因和類胡蘿卜素結合蛋白基因轉家蠶表達研究.pdf

1、隨著化學農藥的大量使用，對環(huán)境造成了嚴重的危害，迫切需要采用生物防治手段來替代。自然界中的農業(yè)害蟲半數以上屬鱗翅目昆蟲，而家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，以其為實驗材料進行生物防治的研究無疑有著重要的意義?；诖?，本實驗室謝潔博士以家蠶幾丁質酶作為靶標，在土壤微生物中篩選得到幾丁質酶抑制物產生菌Pseudomonas sp.1237＃菌株，該菌株發(fā)酵液對家蠶幾丁質酶具有強烈的抑制作用。經鑒定該幾丁質酶抑制物為一種彈性蛋白酶，命名為Chi-

2、Elastase。通過對Chi-Elastase N-端序列的比較分析，設計引物克隆了該蛋白酶編碼基因。在此實驗基礎上，為了進一步驗證Chi-Elastase在生物防治上應用的可行性，本文采用家蠶GAL4/UAS系統(tǒng)對編碼該蛋白酶的成熟肽基因Chi-mELastase進行了轉基因研究。 另外，本文還對類胡蘿卜素結合蛋白基因(CBP)進行了轉基因研究。蠶繭的顏色受到相關基因的嚴格控制，黃、紅繭品系繭色以y基因的存在為前提。免疫學分

3、析表明，CBP蛋白只在攜帶Y基因的家蠶品系中存在，據此推測Y基因可能控制CBP的表達。為了進一步探明CBP基因與Y基因的關系，本研究建立了CBP家蠶轉基因系，對CBP基因進行功能分析。 獲得的主要結果如下： 1 UAS-Chi-mElastase轉基因家蠶品系的建立 本研究利用來源于Pseudomonas sp.1237＃菌株的彈性蛋白酶成熟肽基因Chi-mElastase，構建了轉基因載體pBac[3xp3-D

4、sRed+UAS-Chi-mElastase]，通過顯微注射蠶卵，獲得105個G1蛾區(qū)。經過對中后期胚胎的熒光檢測，篩選到1個轉基因陽性蛾區(qū)。經Southem blot分析表明，轉基因表達盒已經整合到家蠶染色體上，即UAS-Chi-mElastase轉基因家蠶品系構建成功。 2 Chi-mElastase基因表達檢測 將獲得的UAS-Chi-mElastase轉基因系與A3GAL4轉基因系雜交，挑選出同時表達紅色熒光和綠

5、色熒光的轉基因蠶進行Chi-mElastase轉基因表達分析。以中腸和表皮cDNA為模板進行RT-PCR分析，結果顯示靶基因Chi-mElastase在這兩個組織中已經被激活轉錄。 3 Chi-mElastase抗體制備及轉基因蠶蛋白質分析 將Chi-mElastase基因編碼區(qū)序列亞克隆到pET-28a(+)表達載體，構建重組表達質粒，并將該重組質粒轉化BL21菌株。通過IPTG誘導重組菌pET-28a-Chi-mEl

6、astase表達蛋白，得到一個約36kD的重組蛋白(其中標簽蛋白約6kD，目的蛋白約30kD)，與預測分子量大小相符合。表達條件的優(yōu)化，發(fā)現最佳的誘導條件為37℃、0.6mM/L IPTG誘導6h。 通過親和層析，切膠及電洗脫純化原核表達的Chi-mElastase蛋白，免疫小鼠制備抗體。Western blot分析Chi-mElastase蛋白在中腸、表皮和蛹中的表達情況，結果顯示中腸、表皮中沒有檢測到雜交信號，而蛹中有雜交信

7、號的存在。平板透明圈法沒有檢測到該蛋白酶的抑制活性。 4 Chi-mElastase基因對于家蠶生長發(fā)育影響的調查 對UAS-Chi-mElatase轉基因系與A3GAL4轉基因系雜交后代生長發(fā)育情況進行調查。雜交后代根據熒光表達情況分四種情況：既發(fā)紅色熒光又發(fā)綠色熒光，單發(fā)紅色熒光，單發(fā)綠色熒光和不發(fā)熒光。各挑取150頭，在25℃，相對濕度75％的智能人工氣候箱里以人工飼料飼養(yǎng)。觀察既發(fā)紅光又發(fā)綠光的轉基因蠶生長發(fā)育情

8、況，另外三種情況作為對照。結果表明轉UAS-Chi-mElatase基因蠶完成了整個生活史，沒有出現異?，F象，與對照完全一致。 基于所述，本研究獲得了Chi-mElastase轉基因家蠶，RT-PCR結果顯示Chi-mElastase基因已經被GAL4激活轉錄，Western blot分析表明Chi-mElastase基因正確表達。但沒有檢測到Chi-mElastase蛋白的幾丁質酶抑制活性，也沒有觀察到該基因對家蠶生長發(fā)育的影

9、響，轉基因家蠶完成了整個生活周期，與對照相比，并無明顯差異。本研究結果顯示，Chi-Elastase在生物防治上應用的渠道甚至可行性，尚需進一步探討。 5 CBP基因轉家蠶表達研究的實驗結果 本研究將CBP基因分別與BmStart1基因上有調控序列(pBmStart1)、CBP基因上游調控序列(pCBP)及IE1啟動子構建成3個轉基因表達載體。注射蠶卵后，分別獲得139個、31個和51個G1蛾區(qū)。經過對中后期胚胎的熒光檢

10、測，分別獲得5個、1個和1個轉基因陽性蛾區(qū)。經過Southern blot及RT-PCR分析表明，3個轉基因表達盒都已經整合到家蠶染色體上，并都進行了轉錄，CBP基因的表達量在IE1CBP轉基因系中最高，在pcBPCBP轉基因系中次之，在pBmStart1CBP轉基因系中最低。我們觀察了CBP轉基因家蠶的黃血黃繭性狀恢復情況，發(fā)現除了pBmStart1CBP轉基因系外，另外兩個轉基因系都恢復了部分黃血黃繭性狀，恢復程度與RT-PCR結果