抗PRV gC-gH抗體的制備及初步應(yīng)用.pdf

1、偽狂犬病(pseudorabies，PR)是1902年由Aujeszky在匈牙利發(fā)現(xiàn)的，100年來世界上有40多個(gè)國家報(bào)道發(fā)生該病，據(jù)統(tǒng)計(jì)偽狂犬病對(duì)畜牧業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，僅次于口蹄疫及豬瘟。研究病毒與宿主的相互關(guān)系，明確細(xì)胞的重要分子調(diào)控病毒感染的細(xì)胞自身修復(fù)或凋亡機(jī)制，不僅有助于深入理解病毒的致病機(jī)理，開發(fā)新的抗病毒制劑，還為探索細(xì)胞內(nèi)分子事件打開了窗口，而且對(duì)治療病毒性疾病意義深遠(yuǎn)。本研究選擇參與PRV侵入細(xì)胞和病毒釋放的兩個(gè)囊

2、膜糖蛋白gC和gH作為免疫原制備抗體，分析gC蛋白和gH蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)，初步探討PRV的復(fù)制，為下一步闡述PRV與感染細(xì)胞相互作用的研究奠定基礎(chǔ)。
　　 1)構(gòu)建偽狂犬病病毒gC膜外區(qū)部分基因的重組質(zhì)粒，原核表達(dá)并純化重組蛋白，純化蛋白為抗原制備抗-PRV gCN813抗體，并分析獲得抗體的特異性。據(jù)Gen Bank上發(fā)表的偽狂犬病病毒Bartha(PRV Ba)株gC基因的序列(NC EU719641)設(shè)計(jì)并合成了1對(duì)

3、引物，PRV Ba株基因組為模板，PCR擴(kuò)增出PRV gC膜外區(qū)部分基因片段;PCR產(chǎn)物亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)，獲得大小為35kD的重組蛋白His-gCN813;純化的重組蛋白His-gCN813免疫新西蘭大白兔，間接ELISA測(cè)定抗體的效價(jià)達(dá)1∶1000000，Western-blot鑒定所制備的抗-PRV gCN813抗體的特異性。
　　 2)構(gòu)建PRVg

4、H部分基因片段的三個(gè)重組質(zhì)粒，原核表達(dá)并純化重組蛋白，純化的蛋白為抗原制備抗PRV gH抗體，并分析獲得抗體的特異性。據(jù)Gen Bank上已發(fā)表的PRV Ba株gH基因的序列(M61196)設(shè)計(jì)并合成3對(duì)引物，PRV Ba株基因組為模板，PCR擴(kuò)增PRV gH三段基因片段gHN660、gHM687和gHC516;這三段基因分別亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)，獲得大小分別為29

5、kD、30kD和24kD的重組蛋白His-gHN660、His-gHM687和His-gHC516;純化的重組蛋白免疫新西蘭大白兔，間接ELISA測(cè)定抗體的效價(jià)分別為1∶1000000、1∶100000和1∶10000，Western-blot鑒定所制備的抗-PRV gHN660、抗-PRV gHM687和抗-PRV gHC516抗體的特異性。
　　 3)利用獲得的抗體分析真核細(xì)胞中g(shù)C蛋白和gH蛋白的表達(dá)，探討PRV的復(fù)制情況