豬ISG15抗PRV作用及機制的初步研究.pdf

1、干擾素刺激基因15（Interferon stimulated gene15，ISG15）編碼的ISG15蛋白作為抗病毒天然免疫反應中重要的一員，參與腫瘤免疫應答、細胞凋亡、細胞因子表達、轉錄調控等多種生物學過程。作為ISG家族中第一個被鑒定的類泛素蛋白，與泛素相似，ISG15可通過酶級聯(lián)反應與靶蛋白共價結合。目前已證實ISG15的靶蛋白已超過上百種。研究表明，人源和鼠源ISG15具有抗病毒作用和調控干擾素信號通路的作用，但豬源ISG1

2、5的作用尚不清楚。本研究旨在克隆表達豬ISG15，制備多克隆血清，構建穩(wěn)定表達豬ISG15基因的PK-15細胞系，并以此為基礎進一步探究豬ISG15抑制偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)復制的作用，以期探究豬ISG15的功能，并為PR的防控提供新的思路。
　　1.豬ISG15蛋白的表達及多克隆抗體的制備
　　從家豬外周血液淋巴細胞中抽提總RNA，通過反轉錄獲得cDNA，利用GcncBank中公布的野

3、豬ISG15的基因序列設計引物，擴增出豬ISG15基因，測序后，通過生物信息學軟件對其進行分析。ISG15基因片段與pET28a載體連接，構建重組原核表達質粒pET28a-pISG15，轉化至BL21，經(jīng)IPTG誘導表達后，通過N1柱純化，獲得ISG15蛋白。用重組的ISG15蛋白免疫家兔，制備多克隆血清。結果表明，豬ISG15基因CDS區(qū)長504bp，編碼167個氨基酸，包括兩個泛素樣結構域:N端的第3～75位氨基酸肽段，C端的第81

4、～156位氨基酸肽段，及其C末端核心序列LRLRGG。Western blot分析結果表明，重組ISG15蛋白的免疫原性良好，ELISA方法測定結果顯示，血清抗體效價為1∶102400。此試驗為豬ISG15功能的進一步探究奠定基礎。
　　2.穩(wěn)定過表達豬ISG15基因PK-15細胞系的構建
　　將豬ISG15基因克隆于PiggyBac真核轉座子系統(tǒng)中，成功構建PiggyBac-pISG15重組真核表達載體，并通過轉染的方法將

5、豬ISG15基因轉入PK-15細胞，使用濃度為5ug/mL的嘌呤霉素初步篩選兩周后，然后通過有限稀釋法克隆出穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的穩(wěn)定轉染細胞系。通過熒光定量PCR和Western blot檢測豬ISG15基因在穩(wěn)定轉染細胞系中表達的情況。結果顯示，與空載體對照組細胞相比，穩(wěn)定轉染細胞系綠色熒光蛋白的表達穩(wěn)定，豬ISG15基因表達量增加9倍左右，連續(xù)傳代15代，ISG15的表達量依然穩(wěn)定，說明穩(wěn)定表達豬ISG15基因的PK-15細胞株構

6、建成功，命名為PI-15。此試驗為進一步探究豬ISG15的功能提供了有效工具。
　　3.豬ISG15對PRV復制的影響
　　為研究豬ISG15對PRV的影響，本試驗將PRV＿QXX株接種于穩(wěn)定表達豬ISG15的PK-15細胞系（PI-15），分別在接毒后12h、24h、36h和48h收毒，通過熒光定量PCR和蝕斑試驗方法檢測PRV的基因相對表達量和病毒滴度。針對豬ISG15保守序列設計siRNA，利用RNAi技術敲減過表達細

7、胞系中ISG15的表達，在PRV感染情況下，通過熒光定量PCR和蝕斑試驗方法檢測PRV基因的相對表達量和病毒滴度，反向驗證豬1SG15對PRV的影響。結果顯示，與空載體對照組細胞相比，在接毒24h時，豬ISG15過表達細胞抑制病毒的基因表達量達5倍以上，病毒滴度下降了約5倍;ISG15的表達被敲減后，其對PRV復制的抑制作用幾乎消失，反向驗證了豬ISG15具有抑制PRV復制的作用。本試驗為豬PRV的防治提供新的思路。
　　4.豬I

8、SG15對干擾素及相關因子的影響
　　為探究豬ISG15對干擾素信號通路的影響，本試驗構建了重組載體pCAGGS-HA-pISG15，利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測豬ISG15對豬IFN-β啟動子活性的影響，并利用過表達ISG15細胞系，通過熒光定量PCR和ELISA檢測ISG15對豬IFN-β及其他幾種細胞因子表達的影響。結果顯示，豬ISG15可以激活豬IFN-β啟動子，細胞感染PRV前后，過表達ISG15均可上調IFN-β、OAS