抗諾如病毒雞卵黃抗體的制備及其初步應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景:諾如病毒(Nov)與札幌樣病毒(SLV)合稱為人類杯狀病毒(Calicivirus)。該病毒是于1972年，由Kapikian在1968年美國Norwalk地區(qū)暴發(fā)的急性胃腸炎患者的糞便中采用免疫電鏡法檢測出來的球狀病毒顆粒，直徑在27-32nm之間。如今，Nov已成為非細菌性急性胃腸炎的主要病原體?？稍谟變簣@、夏令營、學(xué)校、醫(yī)院、養(yǎng)老院、餐館、部隊（航海艦隊）與游船等小型單位引起暴發(fā)，所有年齡段均可被感染。對新世紀(jì)多次暴發(fā)的

2、腹瀉病原分析發(fā)現(xiàn)，GⅡ型Nov已成為全球病毒性胃腸炎最常見的Nov病毒株，其中GⅡ.4型Nov毒株占主導(dǎo)地位。目前主要采用RT-PCR法檢測食物、糞便和水中的Nov，此法敏感性較高、重復(fù)性好，但耗時較長，儀器設(shè)備要求較高。且由于毒株的多樣性，RT-PCR必須要使用混合引物。如今，RT-PCR已逐漸被熒光定量PCR取代，后者更加快速和靈敏，特別是使用Taqman探針時，單次試驗即可提供證據(jù)并進行定量檢測，但此法儀器設(shè)備要求高，很難在現(xiàn)場和

3、基層普及。
　　 禽類血液中的抗體IgG可轉(zhuǎn)移到卵黃液中，并在胚胎發(fā)育過程中對潛在的各種病原體感染起到被動保護作用，這種抗體稱為卵黃抗體即IgY。IgY是存在于禽蛋卵黃中的主要抗體，屬多克隆抗體，在疾病診斷和防治的應(yīng)用方面有許多優(yōu)點。通過免疫血清的途徑一次性制備大量抗體是相當(dāng)困難的，且多次制備會導(dǎo)致抗體的均一性差。產(chǎn)蛋雞經(jīng)免疫后，可從其卵黃不斷獲得特異性抗體。IgY具有特異性強、純度高等優(yōu)點，不會與哺乳動物產(chǎn)生過敏反應(yīng)或交叉血清

4、反應(yīng)，可替代通過免疫兔、小鼠等哺乳動物而進行抗體的大量生產(chǎn)。近年來，IgY的研究和應(yīng)用已經(jīng)成為免疫學(xué)領(lǐng)域的熱點。Woolley等用重組人白細胞介素-6分別對羊和雞進行免疫，制備了IgG和IgY，發(fā)現(xiàn)兩者對人白細胞介素-6都有很高的親和力，表明IgY可以代替哺乳動物的IgG進行免疫檢測。2003年，de-Almeida CM制備了抗BfpA IgY應(yīng)用于免疫吸附，發(fā)現(xiàn)其可以特異性地鑒定EPEC。Ohnishi T等用IgY與IgG進行EL

5、ISA檢測HGF，發(fā)現(xiàn)IgY使靈敏度提高了10倍，不但能檢測出血中的HGF，還能檢測正常人尿中的HGF。Juliarena等表達了GST-p24融合蛋白，再以此免疫蛋雞制備了特異性IgY用于免疫診斷。結(jié)果表明用IgY檢測可避免常規(guī)的哺乳動物二抗所帶來的交叉反應(yīng)。IgY作為檢測試劑用于一系列的分析技術(shù)，將有望更多的應(yīng)用于診斷試劑的領(lǐng)域，在診斷試劑的開發(fā)中發(fā)揮重要作用。
　　 本研究用GⅡ.4型387型菌株Nov P顆粒蛋白抗原作為

6、抗原免疫產(chǎn)蛋來航雞制備抗Nov卵黃抗體IgY，在此基礎(chǔ)上對IgY進行HRP酶標(biāo)制備酶標(biāo)抗體，建立用于檢測Nov的雙抗體夾心ELISA體系，并進行評價。為IgY今后在診斷和疾病防治方面的應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)，并為Nov的檢測和防治提供新的思路。
　　 研究目的和內(nèi)容:
　　 1.制備特異性抗Nov卵黃抗體IgY。
　　 2.研究特異性抗Nov卵黃抗體IgY的特性。
　　 3.利用特異性抗Nov卵黃抗體IgY建立

7、雙抗體夾心ELISA體系用于Nov的檢測，并對其進行初步應(yīng)用評價。
　　 方法:
　　 1.抗Nov雞卵黃抗體IgY的制備
　　 (1)采用GⅡ.4型387型菌株Nov P顆粒蛋白抗原與等量弗氏佐劑乳化制備免疫制劑，采用多次多點雙翅下肌肉注射的方式免疫產(chǎn)蛋來航雞;
　　 (2)收集免疫前一周及免疫后三個月內(nèi)的雞蛋;
　　 (3)改良水稀釋法和硫酸銨兩次分級沉淀法（終飽和度分別為55％和33％）分離

8、、純化雞卵黃抗體;
　　 (4)間接ELISA法檢測雞IgY各周期的效價變化;
　　 (5) SDS-PAGE電泳鑒定雞IgY的純度，Western blot法鑒定雞IgY的特異性;
　　 (6)考馬斯亮藍法測定雞卵黃抗體中的總蛋白含量;
　　 (7)將卵黃抗體溶液稀釋成不同濃度置于25℃室溫環(huán)境下評價其室溫穩(wěn)定性;在不同pH環(huán)境下作用評價其pH穩(wěn)定性;在不同溫度下處理評價其熱穩(wěn)定性;將其用不同pH環(huán)境的

9、胃蛋白酶進行處理，評價胃蛋白酶對雞卵黃抗體的影響;在-20℃與4℃環(huán)境下反復(fù)凍融5次，評價反復(fù)凍融對其的影響。
　　 2.基于抗Nov雞卵黃抗體的ELISA檢測體系的建立及評價
　　 (1)采用過碘酸鈉法對抗Nov雞卵黃抗體IgY進行酶標(biāo)制備酶標(biāo)抗體;
　　 (2)采用280nm下的紫外吸收法測定酶標(biāo)抗體的蛋白含量，并計算其標(biāo)記率、克分子比值;
　　 (3)利用上述獲得的酶標(biāo)抗體建立雙抗體夾心ELISA檢

10、測體系;
　　 (4)對所建立的雙抗體夾心ELISA檢測體系的各個條件進行優(yōu)化;
　　 (5)評價所建立的雙抗體夾心ELISA體系的最低檢出限、與輪狀病毒和腺病毒的交叉反應(yīng)、批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù);
　　 (6)將所建立的雙抗體夾心ELISA檢測體系與金標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR加測序法比較，對其進行臨床應(yīng)用評價，計算靈敏度、特異度及約登指數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 1.抗諾如病毒雞卵黃抗體IgY的制備<

11、br>　　 (1)改良水稀釋法加硫酸銨兩次分級沉淀法分離、純化的抗Nov雞卵黃抗體的效價在第一次加強免疫后迅速上升，到首次免疫后的第五周效價達到最高為1∶51200，后慢慢下降穩(wěn)定至1∶12800。
　　 (2) SDS-PAGE結(jié)果顯示純度較好，條帶主要集中在66KDa和33KDa左右，雜帶較少。Western blot結(jié)果顯示所制備的雞卵黃抗體IgY可與GⅡ.4型387型菌株Nov P顆粒蛋白抗原發(fā)生特異性結(jié)合。
　

12、　 (3)考馬斯亮藍法測得雞卵黃抗體IgY溶液的總蛋白含量為7.2mg/ml蛋黃液。
　　 (4)理化性質(zhì)評價結(jié)果為不同稀釋梯度的雞卵黃抗體在25℃室溫下保存三個月，IgY效價略有下降，但依然可保持較高活性。在60℃及以下的溫度環(huán)境處理30min后，抗體活性變化不大;在70℃環(huán)境溫度處理30min時，活性稍有下降;IgY抗體在80℃環(huán)境下處理30min后，活性基本消失。雞卵黃抗體IgY在pH3-12范圍內(nèi)活性基本不受影響，而當(dāng)

13、pH值≤2或≥12時抗體活性快速下降。IgY抗體在pH≥3的胃蛋白酶作用下，活性稍有下降，在pH≤2的胃蛋白酶作用下，活性消失。IgY抗體在-20℃與4℃之間反復(fù)凍融后，活性稍有下降，但幅度較小。
　　 2.基于抗諾如病毒雞卵黃抗體的ELISA檢測體系的建立及評價
　　 (1)制得的HRP酶標(biāo)IgY抗體克分子比為1.74，標(biāo)記率為48.73％。蛋白含量為8.58606mg/ml。
　　 (2)對所建立雙抗體夾心E

14、LISA體系的各個條件進行優(yōu)化得最佳包被稀釋度和最佳酶標(biāo)抗體稀釋度均為1∶80，最優(yōu)封閉液為2％BSA，封閉時間為1小時，最佳酶標(biāo)抗體反應(yīng)時間為30min，最佳底物作用時間為15min。
　　 (3)對所建立雙抗體夾心ELISA體系進行評價得最低檢測限為20ng/ml，批內(nèi)變異系數(shù)為1.021％，批間變異系數(shù)為1.150％，與輪狀病毒和腺病毒之間存在反應(yīng)率較低的交叉反應(yīng)。
　　 (4)所建立的雙抗體夾心ELISA體系與金

15、標(biāo)準(zhǔn)相比，檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異，吻合系數(shù)Kappa=0.637，P=0.000，吻合度一般。臨床應(yīng)用評價計算得靈敏度為82.50％，特異度為81.82％，約登指數(shù)為0.6432。
　　 結(jié)論:
　　 1.以GⅡ.4型387型菌株諾如病毒P顆粒蛋白抗原多次多點免疫產(chǎn)蛋來航雞，成功制備了抗諾如病毒的卵黃抗體IgY，效價最高可達1∶51200。
　　 2.SDS-PAGE電泳顯示，卵黃抗體純度較高，雜帶較少，電泳條帶主要

16、集中在66KDa和33KDa處，Western blot顯示IgY對蛋白抗原的特異性較好。
　　 3.改良水稀釋法加硫酸銨兩步分級沉淀法分離、純化雞蛋黃中的抗Nov特異性IgY，具有簡便、快捷、高效的優(yōu)點，制得的IgY抗體活性較高，適合于IgY的大規(guī)模提取。
　　 4.獲得的IgY抗體對溫度、酸堿度的穩(wěn)定性較好，在室溫下穩(wěn)定。在胃蛋白酶作用下或反復(fù)凍融，活性稍有下降。
　　 5.用HRP標(biāo)記卵黃抗體IgY，成功制

17、備了以IgY為基礎(chǔ)的酶標(biāo)抗體。
　　 6.以特異性抗Nov抗體IgY作為包被抗體，以酶標(biāo)抗體為捕獲抗體，建立了用于檢測Nov的雙抗體夾心ELISA體系。對其條件進行優(yōu)化，結(jié)果如下:
　　 (1)包被抗體與捕獲抗體的最佳工作稀釋濃度均為1∶80。
　　 (2)封閉液選取:2％BSA，封閉時間:1小時。
　　 (3)酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)時間:30分鐘。
　　 (4)底物最佳作用時間:15分鐘。