豬體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚構(gòu)建的影響因素研究.pdf

1、基因組定點(diǎn)修飾的轉(zhuǎn)基因克隆豬有益于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類疾病治療。盡管，人們通過體細(xì)胞核移植技術(shù)已經(jīng)得到了克隆豬和轉(zhuǎn)基因克隆豬，并從中摸索出了一些提高體細(xì)胞克隆效率的新方法；然而，由于胚胎體外發(fā)育環(huán)境的缺陷，體細(xì)胞克隆的總體效率仍然較低。本研究旨在建立一套高效的體細(xì)胞克隆豬的生產(chǎn)體系。研究了激素、豬卵泡液及表皮生長因子對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響。系統(tǒng)地探討了供核細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞共培養(yǎng)體系及培養(yǎng)基中能量底物變化對(duì)豬核移植胚發(fā)育的影響。同時(shí)，本

2、研究探討了曲古抑菌素A（組蛋白去乙?；种苿?duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中EGFP的表達(dá)及轉(zhuǎn)基因核移植胚發(fā)育的影響，為轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　 激素、豬卵泡液、表皮生長因子對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟有促進(jìn)作用。卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)過程中，添加10 IU/ml PMSG，10 IU/mlhCG至培養(yǎng)液中，培養(yǎng)22h后撤除激素，卵母細(xì)胞的成熟率顯著高于其他處理（P<0.05）。當(dāng)培養(yǎng)液中添加10％的豬卵泡液時(shí)，卵母細(xì)胞的成熟率顯著高于其他處理（P<0

3、.05）。當(dāng)培養(yǎng)液中添加表皮生長因子時(shí)，10ng/ml處理組的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于0 ng，ml和5ng/ml處理組；然而，10ng/ml處理組和15ng/ml處理組的卵母細(xì)胞成熟率無顯著差異（P>0.05）。
　　 由于大白豬胎兒成纖維細(xì)胞易分離、生長快、傳代能力強(qiáng)，所以選用該細(xì)胞作為核供體細(xì)胞。對(duì)不同傳代次數(shù)的細(xì)胞進(jìn)行染色體分析。結(jié)果表明，傳代7次細(xì)胞的正常核型比例在80％左右，滿足核移植的要求。隨著供核細(xì)胞傳代次數(shù)的增加

4、，重構(gòu)胚的囊胚率下降。用表面光滑細(xì)胞及表面粗糙細(xì)胞分別作為核移植供體，表面光滑的細(xì)胞可以提高供核細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞的融合率。
　　 Yasumura等人從成年非洲綠猴的腎臟分離得到Vero細(xì)胞系。盡管大量的文獻(xiàn)都表明Vero細(xì)胞對(duì)哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育有促進(jìn)作用，然而，Vero細(xì)胞對(duì)豬胚胎發(fā)育的影響尚未見報(bào)道。本文首次使用Vero細(xì)胞作為滋養(yǎng)細(xì)胞，旨在探討共培養(yǎng)體系中Vero細(xì)胞對(duì)豬孤雌胚及核移植胚發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，Vero細(xì)胞

5、共培養(yǎng)組的孤雌胚囊胚率及核移植胚囊胚率顯著高于對(duì)照組（P<0.05），即Vero細(xì)胞共培養(yǎng)體系對(duì)豬孤雌胚及核移植胚的發(fā)育都具有促進(jìn)作用。
　　 將NCSU-23培養(yǎng)基中的5.56 mmol/L葡萄糖替換為0.2 mmol/L丙酮酸、5.7 mmol/L乳酸，并將此培養(yǎng)基命名為mNCSU-23。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，孤雌胚及核移植胚轉(zhuǎn)移到mNCSU-23或NCSU-23中培養(yǎng)。激活第2天統(tǒng)計(jì)孤雌胚及核移植胚中的5～8細(xì)胞胚胎數(shù)。激活第6天

6、統(tǒng)計(jì)孤雌胚及核移植胚囊胚形成率及囊胚細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，mNCSU/NCSU處理組的囊胚率顯著高丁二對(duì)照組（P<0.05）；單純使用mNCSU-23培養(yǎng)豬胚胎時(shí)，囊胚率最低，發(fā)育結(jié)果最差（P<0.05）。結(jié)果證實(shí)，在體外培養(yǎng)前兩天，用乳酸和丙酮酸代替培養(yǎng)基中的葡萄糖對(duì)豬胚胎發(fā)育有利。
　　 目前，外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法主要包括：病毒感染法、原核注射法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等。脂質(zhì)體法操作簡(jiǎn)單，不需

7、要昂貴的儀器設(shè)備，可大批量轉(zhuǎn)染，且對(duì)細(xì)胞毒性作用小。故本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體法將pEGFP-C1載體導(dǎo)入大白豬胎兒成纖維細(xì)胞中，并對(duì)轉(zhuǎn)染參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化：脂質(zhì)體4μl，質(zhì)粒DNA2μg，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染6小時(shí)效率較高。將pEGFP-C1質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入大白豬胎兒成纖維細(xì)胞。經(jīng)G418篩選后，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞。隨傳代次數(shù)增加，EGFP陽性細(xì)胞的比例下降。用曲古抑菌素A預(yù)處理轉(zhuǎn)基因供核細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組（供核細(xì)胞不使用曲古抑菌素A預(yù)處理）。藍(lán)光照射轉(zhuǎn)

8、基因供核細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因的重構(gòu)胚，觀察供核細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因重構(gòu)胚中EGFP的表達(dá)情況。結(jié)果表明，當(dāng)用50nM曲古抑菌素A處理供核細(xì)胞時(shí)，供核細(xì)胞的EGFP陽性率顯著高于對(duì)照組；當(dāng)用50nM曲古抑菌素A處理供核細(xì)胞時(shí)，重構(gòu)胚中EGFP的陽性胚率顯著高于對(duì)照組（重構(gòu)胚融合激活48h后），且這種EGFP表達(dá)的增加至少維持到桑椹胚階段。此外，TSA處理對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞有毒性影響，且這種毒性影響是劑量依賴的；當(dāng)曲古抑菌素A濃度高于50nM時(shí)，大部分細(xì)胞死亡。